论文部分内容阅读
目的:
建立一种高效的骨骼肌细胞分离培养的方法,并在此基础上观察转化生长因子-β1(transforminggrowthfactorbeta-1,TGF-β1)诱导的骨骼肌细胞纤维化转型的作用,探讨肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)调控TGF-β1诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制,为临床治疗失神经喉肌纤维化提供一种新策略和理论依据。
方法:
1、骨骼肌细胞的分离和培养
实验组采用经腹主动脉Ⅱ型胶原酶灌注法消化骨骼肌,取材C57BL/6小鼠趾长伸肌,D-Hanks液冲洗后移入试管以Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶联合振荡消化;对照组小鼠处死后直接取趾长伸肌,D-Hanks液冲洗后用Ⅰ型胶原酶振荡消化,以广口吸管研磨肌腹使肌细胞彻底松散。显微镜下对两种分离方法获得的骨骼肌细胞进行计数,各组均选取完整存活的肌细胞进行培养,不同时间点观察存活率。
2、TGF-β1诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制
C2C12细胞以分化培养基诱导融合为肌管,分化培养72小时后更换培养液为不含血清的DMEM,分别给予不同浓度TGF-β1(Ong/ml,0.1ng/ml,1ng/ml,5.0ng/ml)进行干预,12h后实时荧光定量PCR检测各组CTGF和α-SMA在转录水平的变化,Westernblot检测CTGF和α-SMA在蛋白水平表达变化。
骨骼肌细胞分离后培养24小时,选取存活且状态良好的肌细胞随机分成实验组和对照组,实验组给予TGF-β1(0.5ng/ml)进行干预。12小时后实时荧光定量PCR检测各组CTGFmRNA和α-SMAmRNA的变化,Westernblot检测CTGF和α-SMA蛋白表达变化。
3、HGF调控TGF-β1诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制
将分离培养的骨骼肌细胞随机分成三组:①空白对照组②TGF-β1(0.5ng/ml)诱导组(HGF未干预组)③HGF(4ng/ml)和TGF-β1(0.5ng/ml)共同干预组,12小时后实时荧光定量RT-PCR检测各组CTGFmRNA和α-SMAmRNA的变化,间接免疫荧光法和Westernblot检测CTGF和α-SMA蛋白分布和表达水平。
4、统计学方法
所有实验结果数据以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS16.0统计软件行统计学处理。先进行各组方差齐性检验,符合方差齐性条件,各组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)和t检验;不符合方差齐性条件,采用非参数检验。P<0.05,差异有统计学意义。
结果:
1、两种分离方法获得的骨骼肌细胞的数量、生存率
×5物镜下平均每个视野灌注法获得的肌细胞数为(32.17±2.09)根,研磨法获得的肌细胞数为(10.58±1.15)根,差异有统计学意义(P<0.05)。24h灌注法肌细胞存活率是研磨法的3.20倍,48h灌注法肌细胞存活率是研磨法的2.76倍,72h灌注法肌细胞存活率是研磨法的2.75倍,各时间点生存率差异均有统计学意义(P<0.05)。但灌注法操作时间比研磨法长,且胶原酶消耗大,实验成本高。
2、TGF-β1诱导肌管纤维化转型作用及机制
不同浓度TGF-β1干预下,肌管CTGFmRNA表达量较空白对照组均增高,在1ng/ml浓度时表达量最高为空白对照组的16.03倍,差异有统计学意义(P<0.05);不同浓度TGF-β1干预下肌管α-SMAmRNA表达量较空白对照组均增高,在1ng/ml浓度时表达量最高是空白对照组的4.52倍,差异有统计学意义(P<0.05)。肌管CTGF蛋白表达量较空白对照组均增高,在1ng/ml浓度时表达量最高是空白对照组的1.88倍,差异有统计学意义(P<0.05);肌管α-SMA蛋白表达量较空白对照组均增高,在1ng/ml浓度时表达量最高是空白对照组的1.59倍,差异有统计学意义(P<0.05)。
3、TGF-β1诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制
TGF-β1诱导下骨骼肌细胞CTGFmRNA的表达是空白对照组9.55倍,α-SMAmRNA的表达是空白对照组26.82倍,差异有统计学意义(P<0.05)。TGF-β1诱导下骨骼肌细胞CTGF蛋白的表达是空白对照组3.63倍,α-SMA蛋白的表达是空白对照组3.38倍,差异有统计学意义(P<0.05)。
4、HGF调控TGF-β1诱导的骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制
HGF干预后CTGF和α-SMAmRNA的表达量明显下降,TGF-β1诱导组(HGF未干预组)CTGFmRNA表达量是HGF干预组6.57倍,TGF-β1诱导组(HGF未干预组)α-SMAmRNA表达量是HGF干预组2.64倍,差异有统计学意义(P<0.05)。HGF干预后CTGF和α-SMA蛋白表达量也下降,TGF-β1诱导组(HGF未干预组)CTGF蛋白表达量是HGF干预组2.21倍,TGF-β1诱导组(HGF未干预组)α-SMA蛋白表达量是HGF干预组1.49倍,差异有统计学意义(P<0.05)。各组骨骼肌细胞CTGF和α-SMA免疫荧光均检测到阳性信号,以TGF-β1诱导组(HGF未干预组)信号最强,HGF干预后信号较TGF-β1诱导组(HGF未干预组)减弱。
实验结论:
1、采用胶原灌注法获得骨骼肌细胞数量多,存活率高,比原有方法更具优势。但此法操作时间长,流程较繁琐,需要长期反复实践摸索。
2、TGF-β1可促进骨骼肌细胞和肌管CTGF、α-SMA在转录和蛋白水平的表达,在骨骼肌表型转化进程中发挥重要作用。
3、HGF可以调控TGF-β1诱导骨骼肌细胞表达CTGF和α-SMA,抑制其表型转化,为治疗失神经喉肌细胞化在细胞和分子水平提供了依据。