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目的：
建立一种高效的骨骼肌细胞分离培养的方法，并在此基础上观察转化生长因子-β1(transforminggrowthfactorbeta-1，TGF-β1)诱导的骨骼肌细胞纤维化转型的作用，探讨肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)调控TGF-β1诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制，为临床治疗失神经喉肌纤维化提供一种新策略和理论依据。
方法：
1、骨骼肌细胞的分离和培养
实验组采用经腹主动脉Ⅱ型胶原酶灌注法消化骨骼肌，取材C57BL/6小鼠趾长伸肌，D-Hanks液冲洗后移入试管以Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶联合振荡消化；对照组小鼠处死后直接取趾长伸肌，D-Hanks液冲洗后用Ⅰ型胶原酶振荡消化，以广口吸管研磨肌腹使肌细胞彻底松散。显微镜下对两种分离方法获得的骨骼肌细胞进行计数，各组均选取完整存活的肌细胞进行培养，不同时间点观察存活率。
2、TGF-β1诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制
C2C12细胞以分化培养基诱导融合为肌管，分化培养72小时后更换培养液为不含血清的DMEM，分别给予不同浓度TGF-β1(Ong/ml，0.1ng/ml，1ng/ml，5.0ng/ml)进行干预，12h后实时荧光定量PCR检测各组CTGF和α-SMA在转录水平的变化，Westernblot检测CTGF和α-SMA在蛋白水平表达变化。
骨骼肌细胞分离后培养24小时，选取存活且状态良好的肌细胞随机分成实验组和对照组，实验组给予TGF-β1(0.5ng/ml)进行干预。12小时后实时荧光定量PCR检测各组CTGFmRNA和α-SMAmRNA的变化，Westernblot检测CTGF和α-SMA蛋白表达变化。
3、HGF调控TGF-β1诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制
将分离培养的骨骼肌细胞随机分成三组：①空白对照组②TGF-β1(0.5ng/ml)诱导组(HGF未干预组)③HGF(4ng/ml)和TGF-β1(0.5ng/ml)共同干预组，12小时后实时荧光定量RT-PCR检测各组CTGFmRNA和α-SMAmRNA的变化，间接免疫荧光法和Westernblot检测CTGF和α-SMA蛋白分布和表达水平。
4、统计学方法
所有实验结果数据以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS16.0统计软件行统计学处理。先进行各组方差齐性检验，符合方差齐性条件，各组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)和t检验；不符合方差齐性条件，采用非参数检验。P＜0.05，差异有统计学意义。
结果：
1、两种分离方法获得的骨骼肌细胞的数量、生存率
×5物镜下平均每个视野灌注法获得的肌细胞数为(32.17±2.09)根，研磨法获得的肌细胞数为(10.58±1.15)根，差异有统计学意义(P＜0.05)。24h灌注法肌细胞存活率是研磨法的3.20倍，48h灌注法肌细胞存活率是研磨法的2.76倍，72h灌注法肌细胞存活率是研磨法的2.75倍，各时间点生存率差异均有统计学意义(P＜0.05)。但灌注法操作时间比研磨法长，且胶原酶消耗大，实验成本高。
2、TGF-β1诱导肌管纤维化转型作用及机制
不同浓度TGF-β1干预下，肌管CTGFmRNA表达量较空白对照组均增高，在1ng/ml浓度时表达量最高为空白对照组的16.03倍，差异有统计学意义(P＜0.05)；不同浓度TGF-β1干预下肌管α-SMAmRNA表达量较空白对照组均增高，在1ng/ml浓度时表达量最高是空白对照组的4.52倍，差异有统计学意义(P＜0.05)。肌管CTGF蛋白表达量较空白对照组均增高，在1ng/ml浓度时表达量最高是空白对照组的1.88倍，差异有统计学意义(P＜0.05)；肌管α-SMA蛋白表达量较空白对照组均增高，在1ng/ml浓度时表达量最高是空白对照组的1.59倍，差异有统计学意义(P＜0.05)。
3、TGF-β1诱导骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制
TGF-β1诱导下骨骼肌细胞CTGFmRNA的表达是空白对照组9.55倍，α-SMAmRNA的表达是空白对照组26.82倍，差异有统计学意义(P＜0.05)。TGF-β1诱导下骨骼肌细胞CTGF蛋白的表达是空白对照组3.63倍，α-SMA蛋白的表达是空白对照组3.38倍，差异有统计学意义(P＜0.05)。
4、HGF调控TGF-β1诱导的骨骼肌细胞纤维化转型的作用及机制
HGF干预后CTGF和α-SMAmRNA的表达量明显下降，TGF-β1诱导组(HGF未干预组)CTGFmRNA表达量是HGF干预组6.57倍，TGF-β1诱导组(HGF未干预组)α-SMAmRNA表达量是HGF干预组2.64倍，差异有统计学意义(P＜0.05)。HGF干预后CTGF和α-SMA蛋白表达量也下降，TGF-β1诱导组(HGF未干预组)CTGF蛋白表达量是HGF干预组2.21倍，TGF-β1诱导组(HGF未干预组)α-SMA蛋白表达量是HGF干预组1.49倍，差异有统计学意义(P＜0.05)。各组骨骼肌细胞CTGF和α-SMA免疫荧光均检测到阳性信号，以TGF-β1诱导组(HGF未干预组)信号最强，HGF干预后信号较TGF-β1诱导组(HGF未干预组)减弱。
实验结论：
1、采用胶原灌注法获得骨骼肌细胞数量多，存活率高，比原有方法更具优势。但此法操作时间长，流程较繁琐，需要长期反复实践摸索。
2、TGF-β1可促进骨骼肌细胞和肌管CTGF、α-SMA在转录和蛋白水平的表达，在骨骼肌表型转化进程中发挥重要作用。
3、HGF可以调控TGF-β1诱导骨骼肌细胞表达CTGF和α-SMA，抑制其表型转化，为治疗失神经喉肌细胞化在细胞和分子水平提供了依据。