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miRNAs 是在真核生物中发现的一种具有调控功能的内源性单链非编码小 RNA，长度大约20-25 nt，在不同物种间具有严格的保守性，在动物体内主要参与基因的转录后调控，包括机体发育，器官形成，细胞的增殖和凋亡，肿瘤癌症的发生及脂肪代谢等等。动物脂类代谢是一个极其复杂的生物代谢过程，涉及到许多组织和器官。其中脂肪组织是哺乳动物最大的能源库，主要以甘油三酯的形式储存在脂肪细胞中，而肝脏则是脂类代谢的重要器官。 本实验室前期通过转录组测序筛选出一些与肝脏脂肪沉积有关的miRNAs，经过初步验证选取其中一个差异极显著的miR-34a进行深入研究。综合miR-34a在其他物种上与脂肪沉积的作用我们推测miR-34a可能与猪的肌内脂肪细胞(Intramuscular Adipocyte, IA)的增殖分化有关，因此设计试验方案进行验证。本实验采用靶基因预测软件预测miR-34a的候选靶基因为ACSL4基因，以293T细胞系为试验材料，通过构建ACSL4 3?UTR（包含种子序列）的野生型和突变型重组质粒，采用双荧光素酶系统报告基因试验首先验证miR-34a与ACSL4基因的靶向关系，然后以猪的IA为试验材料研究miR-34a以及其候选靶基因ACSL4对猪IA增殖分化的作用。得到以下结果: 1、通过RT-qPCR初步验证与脂肪沉积有关的5个miRNAs，miR-31、miR-127、miR-96-5p、miR-345-5p、miR-34a，表达差异均达到极显著水平，与转录组测序结果一致。 2、野生型的ACSL43?UTR与miR-34a mimic共同转染293T细胞组，检测到的萤火虫荧光素酶信号与海肾荧光素酶信号的比值与其他对照组均相比显著降低（P<0. 01）且其他各对照组之间无明显差异，即可表明，ACSL4 3?UTR的种子序列可以与miR-34a的种子序列结合猝灭萤火虫荧光素酶的萤火信号使其与海肾荧光素酶信号的比值降低，从而确定ACSL4与miR-34a存在直接的靶向关系。 3、根据IA诱导分化后的生长特性在分化的过程中不同时间段，即0d、2d、4d、6d、8d依次收集细胞，提取RNA，采用RT-qPCR进行候选靶基因ACSL4及其他标志基因表达量的研究; 试验发现ACSL4 mRNA 水平在IA分化前期逐渐上升，在分化第4d表达达到高峰（P<0.001）, 随后呈逐渐下降趋势但仍然趋于较高的表达水平；ACSL4基因与脂肪形成标志基因PPARγ、aP2的表达趋于一致，与脂肪分解关键基因ATGL、Sirt1的则相反。 4、将miR-34a mimic/NC和miR-34ainhibitor/NC分别转染IA2d后，对IA进行诱导，取诱导后0d、4d、8d的细胞进行ACSL4基因的RT-qPCR，发现miR-34a mimic组比其对照组ACSL4基因相对表达量降低，转染miR-34a inhibitor较其对照组ACSL4基因相对表达量达升高，二者在诱导后0d (即转染后2d) 时均达到显著水平(P＜0.05)，在4d、8d时的相对表达量差异不显著，尤其到8d时相对表达量趋于正常表达水平。之后选取诱导后0d (即转染后2d) 的细胞做其他标志基因的定量研究，发现PPARγ、aP2、SREBP-1C基因表达与ACSL4基因趋势呈正相关，ATGL、Sirt1基因则呈负相关（P＜0.05）。 结论：miR-34a在猪高脂肪组肝脏组织中下调表达；miR-34a可以直接靶向ACSL4基因并抑制ACSL4基因mRNA的表达来促进脂肪细胞的增殖分化，从而使脂肪细胞脂滴含量的积累增多。