超分辨定位显微成像技术自从诞生以来,因具有打破衍射极限的超高空间分辨率以及系统简易的特点在生物学领域获得广泛应用。由于在纳米尺度进行生命科学问题的研究通常需要立体三维的空间信息,三维超分辨定位显微成像方法应运而生。在目前实现三维超分辨定位显微成像的方法中,基于光学像散实现的方法由于实现简单且效果好而备受青睐,但是目前缺乏对其实现方法性能的定量分析,从而无法为生物问题依赖的实验过程提供有效的成像优化方案。为了克服上述困难,本论文通过对三维成像系统以及采集后图像处理方法进行全面的定量分析对比,提供了一个优化的实验方案,得到了较优的成像深度及定位精度,为三维超分辨定位显微成像的系统搭建和图像处理提供了很有价值的参考。本文的三个主要工作如下:(1)三维超分辨定位显微成像系统的优化。分析了基于像散的三维成像系统中关键器件——柱面镜的位置及焦距参数对点扩散函数的影响,得到了点扩散函数最优时的柱面镜参数。(2)图像处理方法的优化。首先,分析比较不同的原始图像预处理方法,得到对三维超分辨数据最优的图像预处理方法;其次比较不同的单分子定位算法在基于像散的三维成像中的定位效果,获得在特定成像深度范围内最优的单分子定位算法;最后初步设计并实现了基于GPU并行计算架构的三维数据处理方法,使整个数据分析过程在数据处理速度上得到优化。(3)通过仿真和荧光小球模型实验验证基于本系统优化后的实现效果,并且通过细胞微管成像实验和脑片成像实验得到基于本系统的三维超分辨定位显微成像结果。实验结果表明,优化后的实验方案能够达到更深的成像深度及更高的定位精度。