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碳青霉烯类抗生素是一类具有广谱抗菌活性的抗生素。它是治疗革兰阴性菌感染,特别是肠杆菌科菌的强效药物。近年来,耐碳青霉烯类抗生素的菌株逐渐增多,严重危及公众健康,已引发全球性关注。碳青霉烯酶可以水解碳青霉烯类抗生素。按照Ambler分类法,碳青霉烯酶可以分为A、B、D三类。其中A类和D类酶均为丝氨酸酶,B类为金属酶。产碳青霉烯酶是菌株对碳青霉烯类抗生素耐药的重要原因之一。本研究的主要目的是探索三个产IMP临床分离株耐药的分子机制。前期我们收集了大量菌株,通过各项基础筛查,最终选定3株深入研究:肺炎克雷伯菌0801、产酸克雷伯菌7121、弗氏柠檬酸杆菌17285。0801和7121(来自中国人民解放军307医院)分别分离自不同病人的血液和痰液标本,17285(来自安徽医科大学第一附属医院)分离自中段尿标本。菌株的菌种通过16S rRNA进行鉴定,PCR检测相应的耐药基因类型,碳青霉烯酶类型通过改良Carba NP法进行检测,利用VITEK 2仪器测定菌株的抗生素敏感性,接合转移实验得到相应的接合子,进而验证质粒是否具有可转移性,用Qiagen大提试剂盒从接合子中提取质粒DNA,构建mate-pair文库,通过Miseq仪器完成测序。肺炎克雷伯菌0801、产酸克雷伯菌7121、弗氏柠檬酸杆菌17285均产IMP型碳青霉烯酶,blaIMP分别位于质粒p0801-IMP(登录号:KT345947)、p7121-IMP(登录号:KX784502)和p17285-IMP(登录号:KX784503)上。这三个质粒均为接合型质粒,通过接合转移实验分别获得接合子0801-IMP-EC600、7121-IMP-EC600和17285-IMP-EC600。0801和7121携带的耐药基因均为blaIMP、blaTEM、和blaCTX-M-1group,17285携带的耐药基因为blaIMP、blaTEM。0801-IMP-EC600、7121-IMP-EC600和17285-IMP-EC600均仅含blaIMP。上述的所有野生株和接合子都产B类碳青霉烯酶,均对头孢曲松、头孢他啶、亚胺培南和美罗培南耐药。0801、7121和17285对庆大霉素耐药,其他菌株均表现为敏感。所有菌株均对阿米卡星表现为敏感。p0801-IMP、p7121-IMP和p17285-IMP是首次完成全序测定的携带blaIMP的IncN2型质粒。本研究纳入分析的质粒共6个,Inc N2型质粒的参考质粒pYNKP001-NDM,和5个包含1型整合子的IncN2型质粒(p0801-IMP、p7121-IMP、p17285-IMP、pJIE137和p34983-59.134kb)。比较基因组学分析显示,这6个质粒均可分为骨架区和外源插入区两大模块。其中5个包含1型整合子的IncN2型质粒外源插入区的移动元件有:整合子In1223(p0801-IMP/p7121-IMP)、整合子In655(p17285-IMP)、整合子In27(pJIE137)、整合子In1130(p34983-59.134kb)、ISEcp1-orfRA1-14转座单元(p17285-IMP)、ISEcp1-blaCTX-M-62-Δorf477-orfRA1-14转座单元(pJIE137)和新型Tn1696相关转座子Tn6325(p34983-59.134kb)。In1223和In655均为Tn402-like 1型整合子,In27和In1130为复合型1型整合子。IncN2型质粒通常会整合不同类型的移动元件,这些元件往往会携带耐药基因,多种耐药基因的共存势必会加速菌株的扩散及进化,所以医务工作者和相关部门应提高对耐药菌株传播的防控意识,规范临床抗生素的应用,预防或减缓耐药现象发生趋势。