血吸虫病是一种严重影响人类生命健康和经济社会发展的重大寄生虫病,流行病数据显示全球范围内有2.3至2.5亿人罹患血吸虫病,受血吸虫感染威胁的人数约有7.79亿。在我国仅有日本血吸虫病流行,其生活史、致病机制以及免疫病理特征均比较复杂,迄今仍未完全阐明。研究显示CD4~+T细胞和巨噬细胞的激活在虫卵肉芽肿形成中起到关键作用,其中初始CD4~+T细胞分化增殖为Th1、Th2、Th17、Treg等细胞并分泌相关细胞因子参与血吸虫感染和致病过程。寄生虫感染与癌症的关系复杂,研究认为肝吸虫和恶性疟原虫等分别与肝胆管癌和地方性Burkitt淋巴瘤相关,而弓形虫、克式锥虫等可以抑制癌症发展。日本血吸虫的主要致病因子为虫卵,其沉积在肝脏可引起肝脏虫卵肉芽肿和肝纤维化,继而发展为肝硬化,这些均是原发性肝癌的致癌因子。尽管上世纪六、七十年代我国一些高流行区70%以上人群感染日本血吸虫,但流行病学调查也未明确表明日本血吸虫感染与肝癌相关联。本实验室前期提出假说,即血吸虫感染可诱导宿主产生抗肿瘤的免疫力,并通过大量体内外实验证实此假说:日本血吸虫的虫卵及其分泌物能显著抑制甚至清除在肺脏和肝脏的多种转移瘤,包括B16细胞转移瘤,并表明这种抗肿瘤作用是依赖于组织巨噬细胞及其产生的细胞因子,包括IL-1β等。本课题在此基础上探索日本血吸虫感染诱导宿主产生的免疫应答对血液系统恶性肿瘤生长的影响:通过构建了Zs Green1~+-L1210-luc~+细胞和e GFP~+-A20细胞两株分别表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的小鼠血液肿瘤细胞系,建立小鼠血液肿瘤模型;采用尾静脉注射新鲜分离的日本血吸虫虫卵和小鼠自然感染模型,评估其对肿瘤生长的影响,并通过流式细胞染色计数的方法检测感染小鼠外周血CD4~+T细胞亚群等的动态变化。结果如下:1.虫卵对淋巴瘤和白血病荷瘤小鼠生存时间的影响:首先,我们建立L1210和A20小鼠白血病和淋巴瘤两个动物模型,初步检测新鲜分离的日本血吸虫虫卵(F-egg)对荷瘤小鼠生存期的影响。实验分2组,F-egg组和PBS组(对照组),每组6只小鼠。采用实验室已建立的虫卵分离和处理方法,制备新鲜分离的F-egg,分别在第0、7和14天尾静脉注入小鼠,并在第12天注射肿瘤细胞,每只小鼠2x10~7个。结果显示,在L1210淋巴细胞白血病荷瘤小鼠模型中,PBS组和F-egg组小鼠平均生存时间分别为21.3±2.9和32.7±2.5天,F-egg组小鼠生存时间显著延长(P=0.011)。在A20淋巴瘤荷瘤小鼠模型中,PBS组和F-egg组小鼠平均生存时间分别为27.7±1.7天和36.3±1.6,F-egg组小鼠生存时间显著延长(P=0.018)。2.表达GFP和荧光素酶的Zs Green1~+-L1210-luc~+和e GFP~+-A20细胞系构建:为能计数和观察肿瘤细胞在体内进程中的数量和分布,我们采用慢病毒载体构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶的2株肿瘤细胞,分别定名为Zs Green1~+-L1210-luc~+和e GFP~+-A20细胞株。(1)Zs Green1~+-L1210-luc~+细胞株:用含Zs Green1、荧光素酶(Luciferase)编码基因的慢病毒载体感染L1210细胞系,96h后经流式分选仪分选阳性细胞于体外培养。2个月后使用荧光显微镜和流式细胞术检测该细胞仍稳定表达Zs Green1~+绿色荧光蛋白,并将荧光素酶底物加入裂解后的细胞经荧光素发光检测仪得Zs Green1~+-L1210-luc~+细胞数与荧光素OD值呈正相关(R~2=0.095,P<0.05),即荧光强度随着OD值增加而增强;再将该细胞株经皮下种植于DBA/2小鼠右侧背部,经活体成像仪检测得生物荧光集中于小鼠右侧背部,荧光强度与肿瘤大小相关。(2)e GFP~+-A20细胞系:用含e GFP编码基因的慢病毒载体感染A20淋巴瘤细胞,72h后使用流式分选仪分选阳性细胞于体外培养,2月后使用荧光显微镜检测该细胞并显示其e GFP~+绿色荧光蛋白的稳定表达。3.F-egg对小鼠体内肿瘤生长的作用将Zs Green1~+-L1210-luc~+淋巴细胞尾静脉注入后,各组小鼠未出现肿瘤末期症状。重复该实验,结果相同,提示该细胞系可能因感染慢病毒,易被小鼠免疫系统清除,从而发生小鼠急性淋巴细胞白血病自发缓解状况。这样,本实验重点观察F-egg对e GFP~+-A20细胞的体内抑制作用,分别在第0、7和14天通过小鼠尾静脉注入F-egg、死虫卵(D-egg)和PBS,并在第12天注射肿瘤细胞,观察结果如下:(1)比较荷瘤小鼠末期实体肿瘤形成情况:PBS组,D-egg组和F-egg组成瘤率分别为100%,83.3%和0%。这样,F-egg组小鼠实体瘤形成率相比于其他两个对照组分别减少了100%和83.3%(P<0.001)。(2)小鼠外周血、骨髓和脾脏中肿瘤细胞比例:采用流式细胞术检测表达e GFP~+绿色荧光蛋白的肿瘤细胞比例,在小鼠外周血中,F-egg组的肿瘤细胞比例为(0.4±0.2)%,比PBS组(9.9±3.6)%和D-egg组(11.9±2.6)%的比例分别减少96.0%和96.6%(P<0.001);在骨髓中,F-egg组的比例为(0.7±0.2)%,比PBS组(3.2±1.9)%和D-egg组(3.6±1.5)%的比例分别减少78.1%和80.6%(P<0.05);在脾脏组织中,F-egg组的肿瘤细胞比例为(1.1±0.2)%,比PBS组(5.4±2.1)%和D-egg组(5.2±2.3)%的比例分别减少79.6%和78.8%(P<0.01)。(3)Ki-67和CD20分子表达水平:采用q PCR检测小鼠骨髓中Ki-67和CD20(分别为细胞增殖和弥漫大B淋巴瘤的标志物)的表达水平。结果显示,F-egg组Ki-67的表达水平比PBS组和D-egg组分别减少33.0%和37.3%(P<0.001);F-egg组CD20的表达水平比PBS组和D-egg组分别减少77.1%和76.2%(P<0.001);采用免疫组化方法检测小鼠脾脏,结果显示,F-egg组的CD20面积密度比PBS组和D-egg组分别减少64.3%和74.5%(P<0.001);(4)荷瘤小鼠生存时间:实验分为3组,即F-egg、D-egg和PBS组,每组6只。结果显示,F-egg、D-egg和PBS组小鼠平均生存时间分别为(49.3±4.5)天、(32.8±3.7)天和(31.0±3.2)天,F-egg组小鼠生存时间显著延长(P<0.01)。以上结果表明,F-egg能抑制e GFP~+-A20肿瘤细胞在体内的生长、成瘤及显著延长荷瘤小鼠的生存期。4.日本血吸虫感染抑制e GFP~+-A20小鼠淋巴瘤体内生长为了解日本血吸虫自然感染能否产生对血液系统肿瘤的抑制作用,我们建立日本血吸虫自然感染的小鼠模型,并在感染后第40天接种e GFP~+-A20肿瘤细胞,在感染后第69天收集样本检测。实验分为4组,即感染+肿瘤组、未感染+肿瘤组、感染组和空白对照组,每组6只小鼠,结果如下:(1)比较荷瘤小鼠末期实体肿瘤形成情况:4组小鼠成瘤情况显示,感染+肿瘤组、未感染+肿瘤组、感染组和空白对照组小鼠腹腔和全身肿瘤发生率分别为0%、100%、0%和0%。这样,与未感染+肿瘤组相比,日本血吸虫感染能完全抑制e GFP~+-A20细胞在小鼠体内形成肿瘤。(2)4组小鼠外周血、骨髓和脾脏中肿瘤细胞比例:采用流式细胞术检测表达e GFP~+绿色荧光蛋白的肿瘤细胞比例,在小鼠外周血中,感染+肿瘤组小鼠的肿瘤细胞比例为(0.4±0.2)%,比未感染+肿瘤组的比例(8.4±6.6)%降低了95.2%(P<0.05);小鼠骨髓中,感染+肿瘤组小鼠的肿瘤细胞比例为(0.5±0.1)%,比未感染+肿瘤组的比例(1.7±0.5)%降低了70.6%(P<0.001);小鼠脾脏中,感染+肿瘤组小鼠的肿瘤细胞比例为(0.5±0.2)%,比未感染+肿瘤组的比例(3.9±1.3)%降低了87.2%(P<0.001)。(3)Ki-67和CD20分子表达水平::在小鼠骨髓中,感染+肿瘤组的Ki-67表达水平比未感染+肿瘤组减少了37.9%(P<0.001);感染+肿瘤组CD20的表达比未感染+肿瘤组减少了92.3%(P<0.001)。以上结果表明,日本血吸虫的感染能抑制e GFP~+-A20肿瘤细胞在体内的生长和成瘤。5.日本血吸虫感染小鼠外周血CD4~+T细胞亚群动态变化为了解在日本血吸虫感染进程中,感染小鼠外周血CD4~+T细胞亚群的动态变化,我们采用流式细胞术检测了感染小鼠外周血中CD4~+T细胞亚群(Th1、Th2、Th17和Treg)细胞比例的变化。结果显示,各亚群细胞在感染过程中均呈显著增加。不同细胞亚群比例增加的趋势不尽相同,其中Th1细胞在感染第3周占比较高但其增长较为缓慢,而感染前3周Th2、Treg细胞占比较低但其增加幅度较大,在第8周达到峰值;Th17细胞比例在感染前3周基本无变化,随后显著增加。然而,日本血吸虫感染所致的CD4~+T细胞各亚群变化与其介导抗肿瘤作用的关联性仍有待于进一步研究加以阐明。综上所述,本课题是在本实验室前期实验表明日本血吸虫虫卵及其感染能显著抑制肺部和肝脏肿瘤的基础上,探索日本血吸虫感染及其免疫应答对血液系统肿瘤的抑制作用。首先本课题建立了表达GFP和荧光素酶的肿瘤细胞株以用于检测其体内的数量和分布,并以此建立小鼠动物模型用于研究日本血吸虫虫卵及小鼠自然感染对血液系统肿瘤的作用。本课题结果表明F-egg和自然感染日本血吸虫能显著抑制e GFP~+-A20小鼠淋巴瘤在体内的生长和成瘤,显著延长荷瘤小鼠的生存期,降低Ki-67和CD20分子的表达。本课题结果丰富了我们对血吸虫感染及其免疫应答与抗血液系统肿瘤之间关系的认识,为后续研究阐明日本血吸虫介导的抗血液系统肿瘤的机制、发掘抗肿瘤的效应细胞或分子以及鉴定诱导抗肿瘤作用的虫源分子提供重要基础。