论文部分内容阅读
一、研究背景血管的生成具体指的是在原来存在的血管附近,生长出其他新生的血管。血管内皮生长因子(英文名字为VEGFs),是指可以促进血管生成的一种细胞分泌因子,可以很好的保持血管内膜的完整性。据报道,在体外实验中,DEPTOR在调节血管内皮细胞激活和在炎症及血管生成中起重要的作用。可是,关于DEPTOR在生物体内微血管的生成中的具体作用还不清楚。因此,我们想在体内首次证实DEPTOR与血管生成的关系。二、研究方法1、在Cre-loxP系统上,我们构建了在血管内皮细胞特异性进行DEPTOR敲除的小鼠。2、验证血管内皮细胞特异性DEPTOR敲除小鼠敲除效果。3、采用苏木素-伊红染色、免疫组织化学及western blot等方法,检测敲除小鼠中血管数量变化等表达情况。观察用雷帕霉素处理后血管数量的变化。4、检测KO小鼠VEGF和HIF-1α表达情况。观察用雷帕霉素处理后的变化。5、HUVECs转染DEPTORsiRNA,观察CD31以及促血管生成因子、缺氧诱导因子的变化情况。观察用雷帕霉素处理后的变化。设置对照组、转染DEPTOR siRNA组、转染DEPTOR siRNA +雷帕霉素组,观察各组HUVEC小管形成情况。三、统计学处理在此实验中,所有数据结果均重复3次或以上,结果用均数±标准误来表示,数组间用t检验及两因素方差分析进行分析。当P<0.05代表结果有统计学意义。四、研究结果1、成功构建了在血管内皮细胞进行特异性DEPTOR敲除的小鼠。免疫荧光染色表明DEPTOR蛋白表达在CD31标记的KO小鼠的血管EC中降低。与WT小鼠相比,Western blot结果证明,在KO小鼠组织中的Deptor表达显著降低。2、血管内皮细胞特异性敲除Deptor激活mTOR信号。与WT小鼠相比,KO小鼠组织中pS6明显升高。3、血管内皮细胞敲除Deptor促进了组织血管生成,并且雷帕霉素可以逆转这一表型。与WT小鼠相比,KO小鼠组织,CD31组织化学染色数量显着增加。用雷帕霉素处理KO小鼠时,CD31组织化学染色减少。western blot结果与其一致。4、在KO小鼠中,VEGF和HIFM α的表达增加,雷帕霉素可以逆转这一表型。免疫组织化学染色显示,与WT小鼠相比,KO小鼠的组织中VEGF和HIF-1α的表达增加。用雷帕霉素处理后,与KO小鼠相比,KO + RAPA小鼠中VEGF的染色数量明显减少,Western blot结果一致。5、用 DEPTOR siRNA 转染 HUVEC,CD31,VEGF 和 HIF-1α 的表达也显著增加。用雷帕霉素处理,抑制了 pS6K,pS6的增加,且CD31,VEGF和HIF-1α的表达明显减少。与对照组相比,加入DEPTOR siRNA的HUVEC小管生成增加,而雷帕霉素处理组可逆转增加。五、结论1、在血管内皮细胞内敲除Deptor基因,可以促进mTOR信号通路的活化,进而促进组织血管的形成。2、血管内皮细胞内mTOR信号通路活化,促进VEGF、缺氧诱导因子的的释放,促进血管形成,加雷帕霉素可以减少这一表型。