糖尿病足(DF)是因下肢远端外周血管病变及局部神经异常引起的足部感染、溃疡及深层组织破坏,是糖尿病患者常见的并发症,其发生与多个因素相关,包括长期的糖脂代谢紊乱、血液流变学异常、血管内皮损伤、微循环障碍等。通塞脉(TSM)原有的适应症是脉管炎,但是脉管炎和DF的中西医发病机制存在着相似之处,二者均是由中小动脉狭窄、闭塞导致肢端失去营养而出现溃疡、坏死的血管性疾病,且中医学均将二者归于“脱疽”范畴。因此我们将TSM用于DF的治疗,利用糖尿病足模型,评价TSM对糖尿病足模型的影响,并从血糖血脂、血液流变学、血管内皮细胞功能、VEGF信号通路等角度探讨TSM治疗DF的作用及其机制。方法(1)糖尿病足大鼠模型:选用健康雄性SD大鼠,用高脂高糖加链脲佐菌素(STZ)复制糖尿病大鼠,再行足部手术,建立DF大鼠模型。模型大鼠随机分为5组:模型组、二甲双胍0.135 g·kg-1组、通塞脉片12.44、6.22、3.11 g·kg-1三个剂量组,另设空白对照组,连续灌胃给药18 d,给药期间每天称量大鼠的饲料摄入量、饮水量;每天观察创面愈合情况,给药第4、8、13、18 d分别计算DF大鼠创面愈合率;给药第8、18d分别称量大鼠体重,取血测量空腹血糖和随机血糖。给药18 d后,取血测定血液流变学变化,用生化、放免法、Elisa法检测血清中FINS、GSP、脂质(TC,TG,HDL-C,LDL-C)、TNF-α、IL-6、MDA、SOD、NO、NOS、IVC、LN含量及血浆中ET、6-k-PGF1α、TXB2含量;Elisa法检测大鼠溃疡部位Ⅰ型、Ⅲ型胶原的含量;以HE染色、Masson染色观察足部溃疡面形态学变化(×200);胰腺进行HE染色观察病变情况(×200);采用免疫组化法检测VEGF、SDF1α、p-AKT、p-eNOS在足部溃疡部位的表达及毛细血管的数目(×200);采用Western blot法检测VEGF、SDF1α、p-AKT、AKT、p-eNOS、eNOS在足部溃疡部位的表达。(2)糖尿病下肢病变小鼠模型:在进行糖尿病下肢病变小鼠造模之前,我们首先进行了 DF模型小鼠的造模预试实验,但是由于小鼠足部面积较少且表皮较薄,在小鼠足部制造伤口很容易伤到血管引起出血过多,创伤较为严重,不利于后续观察,因此我们设计了糖尿病下肢病变小鼠模型。雄性ICR小鼠,用高脂高糖加四氧嘧啶(ALX)复制糖尿病模型,再行下肢手术(手术部位为下肢根部背面),建立糖尿病下肢病变小鼠模型,根据血糖和创面面积随机分为5组:模型组、二甲双胍组、通塞脉片17.42g·kg-1组、8.71 g·kg-1组、3.85 g·kg-1组,另设10只做空白对照组。连续灌胃给药12 d,每天称量小鼠的饲料摄入量、饮水景;每天观察创面愈合情况,且于给药第4、8、12 d分别计算小鼠创面愈合率;给药第4、8、12 d分别称量小鼠体重,取血测空腹血糖。给药12d后,取血测定HbAlc,用生化、放免法检测血清中GSP、FINS、脂质(TC,TG,HDL-C,LDL-C)含量,以HE染色、Masson染色观察足部溃疡面形态学变化(×200);胰腺行HE染色观察病变情况(×200);分别于给药第4、8、12 d处死小鼠(每组各10只),并采用免疫组化法检测VEGF、SDF1α、p-AKT、p-eNOS在足部溃疡部位的表达(×100),采用 Western blot 法检测 VEGF、SDF1α、p-AKT、AKT、p-eNOS、eNOS 在足部溃疡部位的表达。结果1.TSM对糖尿病足模型创面愈合情况的影响:模型组大鼠和小鼠创面愈合缓慢,同一时间点伤口面积明显高于其它治疗组,与空白组比较均有显著性差异(P<0.05～0.01)。给予TSM治疗后伤口面积明显减少,创面愈合率明显加快,表明TSM可以促进模型动物的创面愈合,且有一定的剂量依赖性。DF大鼠治疗18 d、小鼠治疗12 d后,光镜下病理组织学观察可见DF模型组局部表皮上皮细胞中度变性,表皮与真皮炎性细胞中度浸润,病变程度显著高于空白对照组;并出现毛细血管增生,纤维结缔组织增生,皮肤附件明显减少等现象。应用TSM进行治疗后,DF模型的病变程度均减轻,可见表皮复层鳞状上皮,局部表皮上皮细胞轻度变性,少量炎性细胞浸润;真皮层见少量炎性细胞浸润,皮肤附件轻度减少,病变程度轻于模型组,其中TSM高剂量组的病变好转最为明显(P<0.05~0.01)。由Masson染色发现在模型大鼠治疗18 d后,空白和给药组创面基本愈合的情况下,胶原纤维合成减少;而模型组胶原纤维明显较多,平均IOD值显著高于空白对照组和TSM 12.44 g·kg-1组,表明模型组由于伤口愈合缓慢,在伤口修复阶段其合成大于分解,胶原形成较多。同时空白组和给药组Ⅲ型胶原较高,Ⅰ型胶原较少,Ⅰ/Ⅲ型胶原的比值明显低于模型组,说明创面愈合的弹性较好,瘢痕少,而模型组创面正处于愈合过程中,瘢痕多。以上结果说明TSM可以通过促进DF溃疡的愈合,加速胶原的合成,明显缩短病程,加快伤口修复。2.TSM对糖尿病足模型一般情况的影响:(1)血糖和胰岛素:DF模型动物空腹和餐后血糖均显著升高,GSP、FINS含量明显增加,胰岛素敏感性降低,胰岛素抵抗加剧(P<0.05～0.01)。HE染色中,模型组胰腺内胰岛结构不清,数目减少,细胞中度变性及坏死,部分导管空泡变性。给予TSM治疗后DF模型动物空腹血糖和餐后血糖均有所降低,GSP含量降低,并可显著降低IR,提高ISI,减轻胰腺变性及坏死(P<0.05～0.01)。说明TSM可以通过降低血糖,减少GSP含量,减轻IR,提高胰岛素敏感性,改善胰岛的结构和形态,促进模型动物的创面愈合。(2)血脂:模型组TC、TG和LDL-C水平均明显升高,HDL-C水平明显降低(P<0.01),表明血脂代谢异常。在给予TSM治疗后TC、TG、LDL-C水平均降低,HDL-C水平升高,尤以TSM高剂量组降低最明显(P<0.01),说明TSM对脂质代谢具有调节作用,可通过改善脂代谢异常、减轻血脂紊乱、降低胰岛素抵抗。3.TSM对糖尿病足模型氧化应激和促炎症因子的影响:(1)氧化应激:模型大鼠血清MDA含量明显升高,而抗氧化的SOD活力明显降低(P<0.01),表明大鼠体内抗氧化系统平衡失调,清除氧自由基的能力降低,脂质过氧化产物明显增加。给予TSM治疗后,血清中SOD活力明显增强,同时MDA含量明显降低(P<0.05～0.01)。表明TSM可以提高模型大鼠清除氧自由基的能力,增强其抗氧化能力,从而减轻过氧化物对血管内皮细胞的直接损伤。(2)促炎症因子:模型大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-6显著升高(P<0.01),TSM 12.44g·kg1组可降低血清中TNF-α、IL-6水平(P<0.05),说明TSM可以通过抑制TNF-α、IL-6的释放,减轻炎症对血管内皮细胞的损伤。4.TSM对糖尿病足模型血管内皮功能的影响:(I)血液流变学:DF模型大鼠血浆中PT、TT、APTT明显缩短,全血黏度、血浆黏度、血小板聚集率明显升高(P<0.01)，表明大鼠体内血液黏度升高,血小板聚集、黏附增强,血流变发生异常,加重血管内皮损伤,促使血管功能发生障碍。给予TSM治疗后,血浆中PT、TT、APTT明显延长,同时全血黏度、血浆黏度、血小板聚集率明显降低(P<0.05～0.01)。表明TSM具有抗凝血、降低血液黏度、改善微循环等综合治疗作用,可以机体凝血功能,促进DF伤口愈合。(2)血管内皮活性因子:DF模型大鼠血清中NO、NOS含量、血浆中6-k-PGF1α水平明显下降,血浆中ET、TXB2、ET/NO、TXB2/6-K-PGF1α比值明显升高,与空白组比较均有显著性差异(P<0.01)。说明DF大鼠ET和NO、PGI2和TXA2的平衡被破坏,容易导致血小板聚集、血栓形成,加重血管内皮细胞损伤的程度。TSM三个剂量组均可升高血清中NO、NOS含量,降低ET/NO、TXB2/6-K-PGF1α比值,其中TSM 12.44 g·kg-1组可以明显升高血浆6-k-PGF1α水平,与模型组比较均有显著性差异(P<0.05～0.01),表明TSM改善ET和NO、PGI2TXA2在体内的平衡,可以保护血管内皮细胞,改善微循环。(3)血管基底膜:DF模型大鼠血清LN、IVCL含量明显增加(P<0.01),表明大鼠体内血管细胞外基质合成增加并发生积聚,血管基底膜增厚,引起微循环障碍和肢端缺血,加重了 DF病变,延缓伤口愈合。给予TSM治疗后,血清中LN、IVCL含量明显降低(P<0.05～0.01),表明TSM可以提高模型大鼠降低血管基底膜的能力,增强对血管内皮的保护作用,从而减轻DF病变,加速溃疡的修复。5.TSM对糖尿病足模型VEGF-PI3K/AKT-eNOS信号通路的影响:给药后18d模型组大鼠VEGF、SDF1α、p-AKT、p-eNOS的表达水平和毛细血管数目明显高于空白组(P<0.05,0.01):TSM 12.44g·kg-1 组VEGF、SDF1α、p-AKT、p-eNOS的表达明显低于模型组,毛细血管的数目明显低于模型组(P<0.05,0.01)。模型组小鼠治疗后4、8 d模型组小鼠VEGF、SDF1α、p-AKT、p-eNOS的表达水平明显低于空白组,治疗后12d模型组小鼠VEGF、SDF1α、p-AKT、p-eNOS的表达水平明显高于空白组,TSM高剂量组治疗后4、8d小鼠VEGF、SDF1α、p-AKT、p-eNOS的表达水平明显高于模型组,12d小鼠VEGF、SDF1α、p-AKT、p-eNOS的表达水平明显低于模型组,说明在伤口修复的后期,给药组VEGF-PI3K/AKT-eNOS的表达呈增长趋势,在伤口修复的后期,给药组VEGF-PI3K/AKT-eNOS的表达呈减少趋势,创面已基本修复完全。提示TSM可以通过调节VEGF-PI3K/AKT-eNOS信号通路的表达,促进伤口愈合,加速修复。结论1.TSM三个剂量组均可促进DF模型的创面愈合,并呈现出一定的剂量依赖性。2.TSM可以通过降低DF模型动物的血糖、血脂,改善脂质代谢紊乱,提高胰岛素敏感性,调节胰岛素抵抗,维护SOD和MDA的平衡、减轻炎症反应,促进DF的伤口愈合,缩短病程,改善创面表皮和真皮的形态变化,加速胶原纤维的形成。3.TSM可以调节DF模型动物的血管内皮活性因子,减少血清NO、NOS和血浆6-k-PGF1α含量,增加ET、TXB2含量,改善ET和NO、PGI2和TXA2在体内的平衡,降低血液黏度和血小板聚集率,调节机体的血液流变性,从而保护血管内皮细胞,减少细胞外基质成分和血管基底膜的合成,抑制血管微循环障碍。4.TSM治疗DF的作用与调节VEGF-PI3K/AKT-eNOS信号通路有关,可以通过VEGF、SDF1α、p-AKT、p-eNOS的蛋白含量,可以促进DF伤口部位的新生毛细血管形成,通过为伤口部位提供良好的血液供应,加快伤口愈合。综上所述,TSM可以降低模型动物的血糖血脂和胰岛素抵抗,抑制过氧化反应和过度炎症,改善血液流变性和血管内皮细胞功能,减少血管中细胞外基质成分的过度沉积,调节VEGF-PI3K/AKT-eNOS信号通路,促进DF伤口愈合,对于减少2型DF的发生来说具有重要意义。