铁皮石斛是我国传统的名贵中药,且具有重要的观赏价值。组织培养是有效利用和保护这一濒危植物的方法,这一过程离不开外源植物激素的添加,较为常用的是细胞分裂素和生长素,规模化育苗生产中往往仅需细胞分裂素。然而,这一育苗过程常产生不同比例的畸形苗,严重影响规模化育苗的效率,并且大量组培苗的推广应用势必为激素诱发潜在相关疾病的发生留下隐患。因此,将组培条件下细胞分裂素引起组培苗的畸变视为一种病变来研究变得十分必要。基于此,本文通过对容易与铁皮石斛产生混淆的其它石斛种进行形态对比分析,以求为铁皮石斛的辨认提供参考,并在这一过程中鉴定了一个石斛新种。同时,选用采自云南广南的铁皮石斛作为后续分析的研究材料,对该研究材料组培小苗进行三组不同浓度的细胞分裂素处理,对相关表型性状的变化进行统计分析,确定激素响应浓度区域,建立了可靠的实验体系。然后对病症进行分级界定,并定义为外源激素诱发的组培苗丛枝病,从而初步展示了细胞分裂素诱发丛枝病的表型特征。最后通过提取三个级别典型症状小苗的总RNA,利用拆分病症表型性状的策略进行转录组分析,结合相关直系同源基因的鉴定,初步揭示了这一病症的分子机理。主要结果和结论如下:1.新种鉴定。在对铁皮石斛为主的品种进行对比分析过程中,我们发现一个石斛新类型,通过对112种石斛属植物进行采样,以该物种相关的四个属作为外类群,,系统发育分析结果显示,该类型与紫瓣石斛和报春石斛聚在一起,共同在sect.Dendrobium中。本种和其它种在花粉和花形上存在明显区别,根据系统发育分析结果和形态差异分析结果,将其确定为一个石斛新种,命名为:版纳石斛(Dendrobium bannaense Y.Q.Tian&Y.B.Huang.)。2.确定组培苗的激素敏感响应区。通过激素初始浓度、激素精细浓度和激素参考浓度的设置和应用,发现激素对供试小苗的作用在2mg·L-1和20mg·L-1的浓度范围存在不同数量和不同程度的敏感响应区。敏感响应区内,浓度的变化对症状没有明显影响,不同敏感响应区激素浓度对症状有不同影响。结果显示,低浓度激素处理随时间推移在芽的生长、根的生长和根系的形成,以及株高等表型性状均能够诱发不同程度的症状,高浓度则在较短时间内诱发的症状更为严重。3.外源激素诱发丛枝病症的分级界定。为了进一步研究激素诱发丛枝病的表型特征,以平均芽数作为主要症状界定指标,将症状程度划分为4个等级,分别从正常的O级到较短时间内死亡的三级。其中,一级为基本正常型(L-S),诱发病症的相应浓度为1.5mg/L,或者更低浓度培养6个月左右;二级为多芽无根型(M-S),相应的激素浓度为19.5 mg/L,或者更低浓度培养6个月左右;三级为多芽多分枝少根型(H-S),相应的激素初始浓度水平为20.5mg/L,并培养3个月以上。4.RNA提取与Denovo组装。三个级别症状的小苗在芽、根和株高方面均具有明显的差异,为了从分子水平进一步了解症状的本质原因,我们做了转录组分析。分别提取三个症状级别典型表型差异样本的总RNA,利用二代测序技术进行测序,构建文库,然后进行Denovo组装。得到相应的contig和unigene,经过归一化处理,计算三个样本的相对表达量。5.转录组分析。得到转录组数据后,我们对症状表型进行了“拆分”,再结合一定的策略对数据进行分析。结果显示,与分枝症状相关的差异表达基因1996个;与无根症状相关的差异表达基因119个;与矮化症状相关的差异表达基因166个;与分枝、无根和矮化等三个症状共同相关的差异表达基因6个。这6个基因分别是:c71492_g1_i1|m.34282、c57389_g1_i1|m.272938、c60692_g1_i1|m.185242、c70260_g1_i2|m.84444、c62908_g4_i1|m.229979、c72344_g1_i2|m.135613。前三个基因可能是作为某个成员和信号分子参与了泛素蛋白酶平衡系统的代谢,以维持细胞分裂素引起的表型变化;而后三个基因则可能是凝集素酶参与了细胞壁的合成,以维持细胞分裂素在三个表型差异样本中的响应。6.相关直系同源基因鉴定。为了克服对性状的“拆分”以及策略所用阈值过严可能存在的不足,也为转录组分析结果与已有结果进行比较和相互应正。我们利用转录组数据和已发表的基因组数据对细胞分裂素代谢直系同源基因和症状相关直系同源基因进行鉴定。在前者的鉴定中,构建了 18例拓扑结构合理,支系支持率较高的NJ树,初步鉴定到了铁皮石斛中与细胞分裂素代谢相关的直系同源基因共90个,其中,单独由基因组数据鉴定到的占92.2%,单独由转录组数据鉴定到的占7.8%,两组数据共同鉴定到的占72.2%。这些基因涉及细胞分裂素的合成与代谢、运输与转导,以及信号响应与调控。这些数据的获得,为我们分析细胞分裂素在样本中的整个代谢过程提供了较为全面的数据基础。在后者的鉴定中,初步鉴定到了铁皮石斛中与症状表型密切相关的基因共174个。其中,单独由基因组数据鉴定到的占93.7%,单独由转录组数据鉴定到的占6.3%,两组数据共同鉴定到的占82.8%。这些基因涉及茎芽分枝与腋芽释放、根器官发育与根系的形成,以及植株生长的阻遏作用。这两方面数据的获得,为分析丛枝病的分子基础提供了较为全面的数据基础。7.症状相关基因KEGG分析。将转录组的分析结果和直系同源基因的鉴定结果进行KEGG通路分析。结果显示,与无根症状相关的转录表达差异基因中,c55572_g1_i1|m.254717、c78288_g2_i4|m.176933、c74031_g1_i1|m.55408 和c61756_g1_i2|m.89069能与直系同源基因中的DcaAHP4、DcaAHP6、DcaA-ARR8和DcaB-ARR11被注释到同一代谢通路;与矮化症状相关的转录表达差异基因中,c70319_g5_i1|m.98190能与直系同源基因中的DcaDELLA、DcaAHP4、DcaAHP6、DcaA-ARR8和DcaB-ARR11被注释到同一代谢通路;与分枝症状相关的转录表达差异基因中,c65683_g1_i3|m.146449能与直系同源基因中的DcaABCG25注释到同一代谢通路。说明这些症状相关的基因在相关症状的代谢通路中具有关联性,同时说明,我们对症状表型的拆分与策略的应用,结合症状相关直系同源基因的鉴定分析方法具有较好的互补性。8.CK运输信号流。通过对细胞分裂素直系同源基因的鉴定,结合相对表达量在三个不同症状级别小苗中的差异表达关系,推测DcaENT1可能介导了iP类细胞分裂素由芽向根的运输,并且可能与DcaABCG14构成了茎芽之间协调生长的信号对话,它们的失调可能导致不同症状的发生。9.丛枝病假定代谢通路。细胞分裂素诱发的丛枝病代谢通路可能存在多个相互关联的反馈调节分支,不同反馈调节分支的失调导致不同症状的发生,失调的分支越多,程度越深,则症状越严重,表型性状变化越大。其中,参与叶酸前体产物合成的三个基因c72344_g1_i2|m.135613、c62908_g4_i1|m.229979和c60692_g1_i1|m.185242,可能参与了丛枝病诱发的整个代谢过程。