原发性胆汁性肝硬化(Primary Biliary Cirrhosis,PBC)是机体一类重要的器官特异性的自身免疫性疾病,其主要病理特征为肝脏门管区小叶间胆管上皮细胞发生变性、坏死及炎症细胞浸润引起的肝内小胆管进行性破坏伴门脉炎症性改变,最终导致胆汁淤积,随着病程进展,肝脏发生纤维化,最终演变成肝硬化,肝癌甚至肝衰竭;临床上95%PBC患者血清中会出现高滴度的抗线粒体抗体(Anti-mitochondrial Antibody,AMA),且以M2型AMA为主;PBC主要高发于中年女性,其中男女发病比例约为1:10;已知的流行病学数据证实PBC的发病率约为0.9-5.8/100,000,其中92%的新发病例为女性,而患病率约为1.91-40.2/100,000,由于人们对PBC的深入认识以及各类治疗手段如熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic Acid;UDCA)的临床应用,PBC在普通人群中的患病率逐年上升;中国人群的PBC流行病学数据显示PBC在中国人群中的发病率约为49.2/100,000,在40岁以上的女性人群中PBC发病率为155.8/100,000。因而PBC在中国乃至世界决非罕见病,对PBC的研究将有助于我们更加透彻的理解PBC的发病机制,制定更有效的治疗方法以及预防措施。PBC的发病具有一定的家族聚集倾向,一级亲属的发病率风险约为11倍,在女性的一级亲属中发病风险更高,许多遗传因素如组织相容性复合物(Major Histocompatibility Complex,MHC)、单基因突变(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)、表观遗传修饰(Epigenetic Modification)等均被认为与PBC的发病密切相关,近来在不同人群中开展的全基因组关联分析(Genome-Wide Association Study,GWAS)研究已筛选出许多与PBC密切相关的重要基因如STAT4、TNFSF15;除了基因因素,已完成的几项大型PBC流行病学研究同样显示PBC的发病与大肠杆菌及某些分支杆菌的感染、外源性化学物质如指甲油、染发剂、吸烟史等密切相关;因而,与其它自身免疫性疾病的病因学相类似,易感的基因遗传背景与外界环境刺激的交互作用共同导致了PBC的发生、发展。而对于PBC具体的发病机制,当前还不是十分清楚,已知突变的易感基因主要集中于多条免疫信号通路,这些信号通路与免疫细胞功能密切相关如骨髓细胞分化、抗原递程、T细胞分化、B细胞抗体分泌及NK细胞促炎因子的产生等;胆管上皮细胞是PBC肝脏病变的重要靶细胞,胆管上皮细胞损伤是PBC发病机制中重要的一环;研究认为胆管上皮细胞表达的T细胞配体是引起胆管上皮细胞损伤的重要原因,而胆管上皮细胞凋亡新生抗原也被证实与PBC胆管特异性损伤密切相关;此外,胆管上皮细胞还可以行使抗原递程细胞的功能,进一步放大自身炎症免疫损伤。至从人类第一次使用原发性胆汁性肝硬化来概括这一类疾病以来,在过去的几十年中科研工作者们在PBC的研究领域中取得了许多成绩,部分研究结果已应用到临床实践中如AMA抗体在临床PBC诊断中的应用、UDCA在PBC治疗中的应用,但是对于PBC的诊断与治疗除AMA与UDCA外,现今并无十分有效的方法与决策;从PBC的病理生理变化可知,PBC的发生发展是一个动态变化的过程,早期主要特征是肝内胆管上皮细胞炎症性损伤,而中晚期特点则与其他慢性肝病相类似表现为纤维化、肝硬化,因而我们认为在PBC发病的不同阶段,其发病机制和主要矛盾存在差异,所以我们应以动态地眼光来探讨PBC特定阶段的发病机制,探寻不同病理阶段潜在的治疗靶点,最终实现对PBC更加针对、更加有效地治疗。TAM(Tyro-3/Axl/Mertk)受体是受体酪氨酸激酶家族的重要一员,包括3个受体(Axl、Mertk、Tyro-3)及2个配体(Gas6、Protein S),调控着机体许多重要的生物学功能,其中最重要的功能是参与凋亡细胞的清除过程;而当前我们知道在PBC患者中,胆管上皮细胞在凋亡后其凋亡产物不能得到有效清除,一些凋亡抗原如PDC-E2会引起机体的自身免疫性反应,这一现象同样解释了为什么在PBC患者中胆管上皮细胞会被特异性的攻击;TAM受体在凋亡细胞清除方面发挥着重要的作用,那么是否在PBC患者中TAM受体同样存在异常呢,当前还没有研究涉及;此外,研究还表明TAM信号通路能够有效抑制炎症因子分泌、抑制免疫反应,Mer基因敲除的小鼠对LPS诱导的内毒素休克异常敏感且在LPS刺激下TNF-α的表达水平也显著升高;PBC作为机体一类重要的自身免疫性疾病,TAM信号通路是否与PBC的高炎症反应密切相关呢,同样不是十分清楚;基于TAM受体信号通路的上述两个功能,我们认为该信号通路在PBC的发病机制可能存在重要的作用。在正常生理情况下,细胞发生凋亡以后会立即被吞噬细胞吞噬清除,这种对早期凋亡细胞的有效吞噬将不会活化巨噬细胞,引起后续的炎症反应,对于维持免疫耐受至关重要;但在某些病理条件下,巨噬细胞未能及时清除凋亡细胞,后者可以继发性坏死,释放炎症因子和自身抗原,诱发炎症反应和特异性免疫应答反应。巨噬细胞是一类异质性明显的细胞群,在不同的环境信号或细胞因子的刺激下,其表型和功能会发生变化,产生极化现象;当前认为极化的方向主要有两种,即M1和M2极化。M1型巨噬细胞(Classically Activated Macrophage,M1,经典活化型巨噬细胞),主要由IFN-γ或LPS等诱导,可以产生诱导性一氧化氮合酶(i NOS)以及TNF-α、IL-12等炎症性细胞因子,抵抗病原菌的入侵,但同时也有助于自身的炎症反应,促进炎症损伤;另一类极化方向为M2型巨噬细胞(Alternatively Activated Macrophage,M2,替代活化型巨噬细胞),主要由IL-4刺激诱导,M2可以产生IL-10、TGF-β等抗炎性细胞因子,高表达清道夫受体等吞噬功能相关的受体,有效清除凋亡的组织细胞残骸、促进组织修复和重塑的作用;由于PBC的动态发病机制,在PBC患者中巨噬细胞的极化方向是否存在异常,当前也不是十分清楚。基于TAM信号通路、巨噬细胞极化与PBC的潜在联系,我们拟通过本研究探讨二者在PBC中的作用;主要拟解决以下几个问题:第一,探讨TAM受体与配体在包括PBC在内的相关自身免疫性疾病的m RNA表达水平;第二,分析游离的TAM受体家族分子在PBC患者中水平及其临床意义;第三,探讨PBC患者巨噬细胞极化水平的变化以及与Mer受体表达水平的相关性;第四,初步探讨Mer受体在PBC中调控巨噬细胞极化的潜在生物学机制。第一部分:TAM受体家族在自身免疫性疾病中的m RNA表达水平及其临床意义在本部分研究中,我们纳入了原发性胆汁性肝硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、原发性干燥综合症以及健康对照者,使用RT-PCR方法对比分析上述几类自身免疫性疾病患者外周血单个核细胞中TAM受体及其配体的m RNA表达水平并分析其表达水平与患者的临床特征间的相关性;结果显示TAM受体家族分子无论受体还是配体在自身免疫性疾病的外周血单个核细胞中均存在不同程度的异常表达,在类风湿性关节炎患者中Gas6与Tyro-3、Axl呈现显著的低表达水平,在系统性红斑狼疮患者中Gas6、Protein S、Axl显著低表达且这种低表达与系统性红斑狼疮患者的疾病严重程度及炎症反应水平密切相关;而在PBC患者中,Pro S与Axl的表达水平显著地降低,但与PBC患者的临床特征无显著相关性;该部分研究结果说明在自身免疫性疾病中TAM受体家族存在不同程度地低表达水平,基于TAM受体信号通路的功能进一步反映该信号通路在自身免疫性疾病发病机制中潜在的作用。第二部分:原发性胆汁性肝硬化患者血清游离TAM受体家族分子水平及其临床意义;本部分研究中,我们检测了原发性胆汁性肝硬化患者血清中游离TAM受体家族分子(s TAM)的浓度水平,发现PBC患者血清中Pro S浓度显著降低(102.1±10.0ug/ml vs 108.6±5.6 ug/ml,p<0.01),而s Mer、s Tyro-3的浓度水平在PBC患者血清中显著的高于健康对照者(21.1±7.5 ug/ml vs 17.1±2.65 ug/ml;8.51±4.0ug/ml vs 5.18±1.74 ug/ml),临床相关性分析结果显示:s Mer水平与PBC患者的AKP、GGT、TBA水平呈现显著的正相关性(r=0.33,p<0.01;r=0.65,p<0.01;r=.73,p<0.01),同样,s Tyro-3的浓度水平与AKP、GGT、TBA呈现显著的正相关性(r=0.48,p<0.01;r=0.49,p<0.01;r=.49,p<.01),进而说明在肝功能较差的PBC患者中游离的s Mer、s Tyro3水平要显著增加;随后的诊断试验显示s Tyro-3在PBC中的诊断ROC曲线下面积达到0.77(95%c CI 0.69-0.85),敏感度达0.70,特异度为0.78,其中Cutoff值为6.30 ug/ml;s Mer的ROC曲线下面积为0.66(95%CI 0.56-0.76),敏感度达0.63,特异度为0.72,其中Cutoff值为17.7 ug/ml;Pro S的ROC曲线下面积为0.68(95%CI 0.59-0.78),敏感度达0.87,特异度为0.47,其中Cutoff值为103.1 ug/ml;由此可见,血清中游离地TAM受体家族分子在PBC的诊断中具有重要地临床意义。第三部分:原发性胆汁性肝硬化患者外周血单核巨噬细胞中TAM膜受体表达水平、巨噬细胞极化情况及二者之间的相关性;在本部分研究中,我们主要分析了原发性胆汁性肝硬化患者外周血单核巨噬细胞极化情况,流式结果显示在早期PBC患者中M1型巨噬细胞(CD68+/CCR2+)的比例要显著高于晚期PBC患者(p<0.05);M2型巨噬细胞(CD163+/CX3CR1+)在晚期PBC患者外周血中比例要显著高于早期PBC患者(p<0.05);由于不同极化类型的巨噬细胞分泌特异性细胞因子,为了进一步验证PBC患者外周血M1与M2型巨噬细胞分布情况,我们检测了TNF-α、IL-12、TGF-β、IL-10的浓度水平;结果显示在早期PBC患者中IL-12水平显著高于晚期PBC患者(129.7±51.3 pg/ml vs 87.8±23.9 pg/ml,p<0.01),而TGF-β水平显著低于晚期PBC患者(5384.0±4055.8 pg/ml vs 14182.8±10894.6 pg/ml;p=0.02);由于TNF-α、IL-12为M1型巨噬细胞特异性细胞因子,而TGF-β、IL-10为M2型巨噬细胞特异性细胞因子,进一步证实PBC不同阶段的M1/M2分型情况。此外,本部分使用流式细胞术检测了不同阶段PBC患者与健康对照者外周血单核巨噬细胞群中TAM膜受体(m TAM)表达水平,在早期PBC患者中m Mer水平显著低于晚期PBC患者(p<0.01),而对于其它两个膜受体m Tyro-3、m Axl在早晚期PBC患者中未见明显差异;基于不同阶段PBC患者中M1与M2型巨噬细胞比例以及TAM膜受体表达水平,我们进一步分析了M2/M1比值与m Mer、m Tyro-3、m Axl的相关性;结果显示m Mer与M2/M1比值呈现显著正相关(r=0.57,p<0.01),即M2巨噬细胞比例随着m Mer表达升高而增加;此外,我们对M2/M1比值与PBC患者的临床特征进行了相关性分析,分析结果显示:M2/M1比值与DBIL、AKP水平呈现正相关性(r=081,p<0.01;r=0.71,p<0.01),即PBC患者血清中DBIL、AKP水平随着外周血M2/M1比值的升高而增加;本部分研究证实PBC患者外周血中巨噬细胞极化情况与m Mer水平密切相关。第四部分:初步探讨Mer对巨噬细胞极化的调节作用及其潜在生物学机制;本部分研究中,我们初步探讨了TAM受体在巨噬细胞极化过程中的生物学机制;使用si RNA-Mer下调M0型巨噬细胞Mer表达后共培养凋亡胆管上皮细胞与M0型巨噬细胞,通过流式细胞术检测M2型巨噬细胞比例:在未加入si RNA-Mer组中,CD163+/CX3CR1+细胞比例显著高于加入si RNA-Mer,从而可知Mer表达水平可以有效促进M2型巨噬细胞方向极化;除了流式细胞术检测M2型巨噬细胞表型,为了进一步说明Mer受体对M2巨噬细胞极化的影响,同时检测了M2型巨噬细胞特异性基因包括CD206、CCL18、RANTES、MDC的表达以及特异性细胞因子TGF-β、VEGF、IL-10、TNF-α、IL-12的表达水平;结果显示CCL18及RANTES的表达水平在si RNA-Mer干扰后显著降低,而M2型巨噬细胞因子TGF-β、IL-10的表达水平显著的同样显著降低;随后进一步分析si RNA-Mer对M2型巨噬细胞极化调控过程中的相关信号通路的影响,发现在转染不同浓度的si RNAMer后巨噬细胞中总Akt蛋白水平无明显改变,而磷酸化Akt蛋白水平显著降低,且呈现剂量依赖性;随后使用Akt激动剂SC79模拟p-Akt功能后检测细胞培养液上清中M2型巨噬细胞比例,结果显示Akt激动剂SC79可以有效的中和si RNAMer对M2型巨噬细胞极化的抑制作用;结合上述M2型巨噬细胞表型、M2型特异性基因与细胞因子的水平变化,我们认为Mer主要通过影响下游信号通路Akt的磷酸化水平(p-Akt),进而调控M2型巨噬细胞极化;此外,si RNA-Mer可以降低细胞培养上清中IL-10、IL-13的表达水平,而同时加入SC79后细胞上清上IL-10、IL-13水平显著升高;综合以上研究结果,本部分研究认为Mer受体能够促进M2型巨噬细胞极化,而其潜在的生物学机制是Mer受体通过调控p-Akt信号通路进而影响M2型巨噬细胞诱导因子IL-10、IL-13的表达与分泌,参与M2型巨噬细胞极化。