论文部分内容阅读
CtBP(C-terminal binding protein)蛋白家族是一类非常经典的转录辅阻遏因子,在发育和疾病中发挥着重要的作用,它主要通过和序列特异且与DNA结合的转录阻遏因子相互作用,并募集染色质修饰相关的因子,改变染色质状态,行使转录辅阻遏因子的功能。CtBP在结构上与一类NAD依赖的D2-羟基酸脱氢酶(D2-HDH)具有高度的同源性,并被认为是有功能性的脱氢酶,此外,由于CtBP的活性受细胞内NADH/NAD+水平的影响,近年来不少研究都表明CtBP的转录调控功能与细胞代谢有着密切的联系。但是至今为止CtBP真正的生理学底物还未被鉴定出来,所以在这一领域仍有很多问题亟待解决,例如CtBP的真正底物是什么,底物是如何影响CtBP功能的?其脱氢酶活性是如何调控RNA转录及染色质构象的?CtBP的转录调控功能与细胞代谢状态之间的联系是通过哪些方式建立的?本文通过体外生化试验和细胞实验初步探究了 CtBP和代谢酶PHGDH之间的关系,寻找到了 CtBP的一个潜在底物3-磷酸甘油酸(3PG)。我们进一步发现CtBP与PHGDH存在物理相互作用,并且存在功能上的联系。此外我们还对3PG等代谢物对CtBP功能的影响进行了初步探讨,发现3PG和NADH可以协同促进CtBP二聚体的形成,同时NADH/NAD+水平的改变可能与CtBP的亚细胞定位有关。鉴于PHGDH在氨基酸合成、核酸合成及一碳单位来源中的重要作用,本文的结果提示CtBP可能通过与PHGDH的相互作用发挥其在转录调控和细胞增殖中的功能。以下是这篇论文的主要结果:1.CtBP蛋白与代谢酶PHGDH的关系以CtBP的脱氢酶结构域为线索,我们在NCBI上分别进行了果蝇和人的蛋白序列比对,发现果蝇的CG6287蛋白和人的PHGDH蛋白与CtBP有着较高的同源性,之后通过在果蝇数据库FlyBase中的检索,我们发现CG6287在人中的直系同源基因即为PHGDH,编码的蛋白为3-磷酸甘油酸脱氢酶,在进化上也属于D-2-羟基酸脱氢酶,其底物为3-磷酸甘油酸(3PG),为方便起见,我们将CG6287命名为dPHGDH。鉴于CtBP与PHGDH的同源性及各自特异的转录调控和代谢功能,我们提出一个设想:PHGDH和CtBP可能是同工酶,而且PHGDH可能是CtBP与细胞代谢环境建立联系的一种机制。由于PHGDH和CtBP可能是同工酶,我们以3-磷酸甘油酸为底物,将已报道的CtBP酶活检测底物丙酮酸作为对照,检测CtBP的酶活,结果表明在在相同浓度条件下(100μM),以3PG为底物时,CtBP的酶活远高于丙酮酸,说明3PG可能是CtBP的潜在生理学底物。为了探究CtBP蛋白与代谢酶PHGDH的功能关系,我们分别利用Co-IP和细胞免疫染色实验证明了 CtBP和PHGDH在细胞中共定位,并存在直接或间接的相互作用。此外,Wnt信号通路转录调控模型中的研究表明,在CtBP RNAi或CtBP和Gro双重RNAi的情况下,Wnt信号通路被激活后,CtBP靶基因nkd表达水平上升了 6-7倍,而在转染了 PHGDH后,nkd的表达又受到了抑制,说明PHGDH在一定程度上弥补了 CtBP的转录辅抑制功能,两者可能具有功能上的相互联系。2.代谢中间产物能够影响CtBP的功能为了检测3PG对CtBP功能的影响,我们以不同浓度3PG处理Kc细胞,同时以文献中报道的CtBP的另一个潜在底物MTOB作为对照,检测Wnt信号通路靶基因nkd的表达水平。结果显示在用3PG和MTOB处理细胞后,CtBP的靶基因nkd受到抑制,这与CtBP过表达的结果相似,说明3PG和MTOB能在一定程度上促进CtBP的功能。此外我们分别用带V5和Flag标签的CtBP质粒共同转染Kc细胞,免疫共沉淀(Co-IP)实验时分别用NADH、3PG及对照MTOB处理样品,检测它们对CtBP二聚体形成的影响。结果显示单独的3PG和MTOB处理不能促进CtBP二聚体的形成,而NADH和3PG(或MTOB)同时处理后能协同促进CtBP二聚体的形成,这可能是CtBP潜在底物能够增强其功能的一种机制。我们还研究了细胞内NADH/NAD+水平对CtBP功能的影响,结果表明在用糖酵解抑制剂2-DG处理细胞后3h,CtBP的抑制活性减弱。同时,我们还观察了 2-DG处理细胞3h后CtBP的胞质和核定位情况,结果表明在用10mM2-DG处理细胞3h后,CtBP在胞质中的积累增加,而核中减少。这一结果表明,细胞中NADH/NAD+比率的变化不仅能通过影响CtBP二聚体的形成及其与其他蛋白的相互作用来调控CtBP的功能,还能通过影响CtBP的亚细胞定位来调控其功能分布。综上所述,我们对于CtBP蛋白和代谢酶PHGDH关系的研究,3PG、NADH调控CtBP功能的研究,间接证明了代谢对转录调控和染色质修饰的影响,为我们进一步认识代谢、转录调控和疾病之间的关系提供了一定的借鉴。