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1目的药物成瘾是一种以强迫性觅药、无限制用药、中断用药后出现戒断症状为典型特征的慢性复发性脑病。由于药物成瘾的精神依赖机制复杂,治疗困难,成瘾病人复吸率高（高达95%）,因此解决药物成瘾中的精神依赖和复发问题,具有极其重要的社会和科学意义。很多研究认为,中脑边缘多巴胺系统（mesolimibic dopamine system,MLDS）是药物奖赏效应产生的神经解剖学基础。另外还有研究报道,伏隔核（nucleusaccumbens,NAc）、海马（hippocampus,Hp）、前额叶皮质（prefrontal cortex,PFC）等奖赏记忆相关脑区的N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartatereceptor,NMDAR）的NR2B蛋白上调与吗啡成瘾记忆的形成、维持及重现呈正相关关系。选择性NR2B拮抗剂艾芬地尔经系统或核团给药实验证明,阻断伏核或海马CA1区的NR2B可抑制药物或应激诱发的吗啡条件性位置偏爱（conditionedplace preference,CPP）复燃,而对维持个体生命所需的食物、社交等天然奖赏记忆和空间记忆的获得和重现没有明显影响,提示NMDA受体的NR2B亚基有望成为研究对抗阿片成瘾药物的新靶点。NMDA受体是兴奋性谷氨酸受体的药理学亚型之一,是由不同比例的NR2（NR2A-D）和/或NR3与NR1（NR1a-h）亚基组成的异四聚体或异五聚体,具有配体和电压门控双重特性,并对Ca2+具有高通透性,涉及突触信号转导、神经可塑性、学习记忆等重要的生理过程。近年来有研究发现,Src家族酪氨酸激酶（Srcfamily kinases,SFKs）通过对NR2A/NR2B亚基C末端酪氨酸残基的磷酸化,在NMDA受体介导的兴奋性突触后信号转导、突触可塑性和记忆的形成过程中发挥重要作用。由于前额叶皮质和海马脑区与成瘾学习记忆有关的其它多个脑区具有广泛的联系,参与了与药物奖赏有关的多种学习和记忆过程。同行和本实验研究也发现长期吗啡精神依赖小鼠的前额叶皮质和海马脑区内有多种蛋白发生异常改变,但其中SFKs的确切作用尚未阐明。芋螺毒素（Conotoxin）中的Conantokins（con）家族是目前唯一已知的抑制NMDA受体的天然多肽,其成员主要包括Con-G、Con-T、Con-R、Con-L、Con-Pr1、Con-Pr2、Con-Pr3和Con-P。同行研究和本实验室前期研究表明,Con-G具有干预吗啡躯体依赖和精神依赖的潜力,但此肽含有的γ-羧基谷氨酸残基使其难以通过生物表达或化学合成获得,限制了进一步的开发利用。我们发现具有相似药理学作用的Con-G类似物[Glu3,4,7,10,14]-Conantokin-G（Glu-Con-G）对吗啡诱导小鼠的奖赏效应有一定的干预作用,且合成方便,成本更低,具有更好的应用前景。此外,已有文献指出Con-G可以阻断多种激动剂（如NMDA、谷氨酸）诱导的NMDA受体兴奋后产生的Ca2+内流,而SFKs可被胞内多种信号分子激活,其中也包括Ca2+,故推测其类似物Glu-Con-G可能也是通过阻断NMDA受体兴奋后产生的Ca2+内流从而间接调节SFKs的活化。本研究旨在利用视频跟踪-计算机自动分析的条件位置偏爱（conditioned placepreference,CPP）实验系统,进一步证实Con-G和Glu-Con-G抗吗啡精神依赖的药效,为进一步设计、筛选防治吗啡依赖的芋螺毒素类似物提供理论和实验依据;应用免疫印迹方法（western blotting）检测吗啡成瘾小鼠前额叶皮质和海马脑区SFKs磷酸化[pSFKs（Tyr416）]水平的变化,探讨SFKs在吗啡成瘾中的可能作用机制。2材料和方法2.1实验动物清洁级雄性昆明种小鼠,体重18-22g,自由摄取食物和水。适养2周后开始实验。2.2主要药物和试剂盐酸吗啡注射液;生理盐水;Conantokin G（Sigma,产品号:C4311,纯度＞75%）;[Glu3,4,7,10,14]-Conantokin-G（Sigma,产品号:C1733,纯度＞90%）。Phospho-SrcFamily（Tyr416）一抗（Cell Signaling Technology）;Src一抗（Cell SignalingTechnology）;Actin一抗（Cell Signaling Technology）;辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗。2.3 CPP实验装置视频跟踪-计算机自动分析系统主要由隔音箱、小鼠活动盒、摄像系统和计算机组成。小鼠活动盒为4个相同的长方形PVC材料穿梭盒（30×15×15cm）组合成一个45×45×15cm的正方形盒子,每个穿梭盒被一块隔板分成两个大小相同的正方形盒子（15×15×15cm）,其中一个盒子四周均为白色,底面光滑,作为伴药盒;另一个四周均为黑色,底面镂刻成网格。采集的视频图像用改进后的Rat/MiceTracking软件进行分析。实验时背景噪音＜30dB,活动盒底部平均照度15-20Lux。2.4 CPP训练程序包括天然偏爱测试、CPP建立、CPP表达、CPP消退及CPP复燃五个阶段,具体操作步骤如下:天然偏爱测试:实验开始前三天（d-2、d-1、d0）,穿梭盒中间采用通道型隔板,将小鼠放置两盒交界处,让其在两盒内自由活动15分钟,摄录活动情况,分析其天然偏爱情况。根据天然偏爱测试结果将小鼠随机分为12组,包括溶剂对照组（NS、NS-NS）,吗啡对照组（Mor、M-NS）,芋螺毒素对照组（NS-G120、NS-C120）和芋螺毒素干预组（M-G30、M-G60、M-G120、M-C30、M-C60、M-C120）。CPP建立:选择白盒作为伴药盒,进行条件化训练。训练阶段采用封闭型隔板将穿梭盒分隔成两个独立的盒子,吗啡处理组小鼠在d1、d3、d5、d7腹腔注射5mg/kg的盐酸吗啡后放置白盒训练50分钟;d2、d4、d6、d8腹腔注射0.5ml/kg生理盐水后放置黑盒训练50分钟。对照组小鼠8天内均给予生理盐水,其它处理同实验组小鼠。CPP表达:实验d9,采用通道型隔板,将不同组别小鼠相应给药处理半小时后,放置两盒交界处,让其在两盒内自由活动15分钟,摄录其活动情况。CPP消退:第一次CPP测试后第二天,即d10开始,实验组和对照组小鼠均给予生理盐水,d10、d12、d14、d16放置白盒训练50分钟;d11、d13、d15、d17放置黑盒训练50分钟。d18,中间隔板换成通道型,小鼠未作任何处理放置两盒交界处,让其在两盒内自由活动15分钟,摄录其活动情况。CPP复燃:确定CPP消退后第二天,即d19,吗啡组小鼠给予2.5mg/kg小剂量吗啡后,放置两盒交界处,让其自由活动15分钟,摄录活动情况,Rat/MiceTracking软件分析。2.5芋螺毒素给药处理Con-G及Glu-Con-G以生理盐水做溶剂。在吗啡诱导CPP表达测试（d9）和复燃测试（d19）前半小时,芋螺毒素干预组小鼠右侧脑室分别给予30、60、120pmolCon-G和Glu-Con-G,芋螺毒素对照组小鼠分别给予120pmol Glu-Con-G和Con-G,溶剂对照组小鼠给予生理盐水,颅内给药容量均为2μl/只。2.6免疫印迹实验步骤取PFC和Hp脑区提取总蛋白,灌制SDS-PAGE凝胶（10%分离胶和5%浓缩胶）,每孔30μg上样,80V恒压电泳后恒流200mA湿法电转膜。5%BSA/TBST溶液室温封闭2h后抗Phospho-Src Family（Tyr416）一抗（1:2000）4℃轻摇过夜,TBST洗膜后放入HRP标记的羊抗兔二抗液（1:5000）室温孵育1h,显影、定影。再将膜放入双蒸水中漂洗数次;5%BSA/TBST溶液室温二次封闭2h;TBST洗膜后抗Src一抗和Actin一抗的稀释液（1:4000）4℃轻摇过夜;TBST洗膜后二抗（1:5000）,温和振荡1h,显影、定影。2.7实验观察指标及统计分析Rat/Mice Tracking软件分析位置偏爱指标:白盒停留时间;运动活性指标:总运动距离、穿梭次数;探索行为指标:总中心停留时间、白盒中心停留时间与白盒停留时间的比值、总中心徘徊距离与总运动距离的比值以及白盒中心徘徊距离与白盒徘徊距离的比值。Western blotting实验结果光密度测定:胶片用光密度扫描仪（GS-800型）扫描入计算机,用Bio-Rad Quantity One?图像分析软件分析每张胶片中各条带的平均灰度,pSFKs（Tyr416）和SFKs蛋白分别以每张胶片中相应条带SFKs蛋白和内参Actin蛋白的灰度做标准计算相应比值,同一胶片中各组蛋白条带的灰度值以生理盐水对照组pSFKs（Tyr416）和SFKs蛋白条带的相对灰度值进行标化,以百分数表示其含量的高低,进行半定量分析。用SPSS统计软件对以上数据进行统计分析,均用Mean±SEM表示,P＜0.05视为有统计学差异。3结果3.1 Con-G及其类似物Glu-Con-G对小鼠奖赏效应的影响3.1.1天然偏爱测试天然偏爱结果显示:各组小鼠在黑盒停留时间（s）均显著长于白盒停留时间（分别为529.8±6.1和369.2±6.1,P＜0.05）,表明小鼠天然偏爱黑盒;同时各组间小鼠的黑盒停留时间无明显差异（P＞0.05）。3.1.2 CPP建立经过8天的CPP训练,5mg/kg吗啡组（Mor）小鼠在训练后的白盒停留时间显著长于训练前（分别为513.5±7.6和378.0±17.3,P＜0.05）;与生理盐水组（NS）相比,吗啡组小鼠白盒内的停留时间显著增加（分别为513.5±7.6和403.2±13.8,P＜0.05）,表示小鼠已建立对白盒的位置偏爱。3.1.3 CPP消退经过8天的CPP消退训练,d18吗啡组小鼠在白盒内的停留时间与对照组小鼠白盒停留时间无明显差异（P＞0.05）,表示小鼠对白盒偏爱不明显。3.1.4 Con-G、Glu-Con-G对CPP表达及复燃阶段各组小鼠、运动活性及探索行为的影响吗啡诱导CPP的表达阶段,与溶剂对照组（NS-NS）相比,吗啡对照组（M-NS）小鼠白盒停留时间明显增高（分别为535.6±21.4和435.0±30.7,P＜0.05）,而芋螺毒素对照组（NS-G120,NS-C120）小鼠白盒停留时间均无显著性变化（P＞0.05）;同吗啡对照组（M-NS）相比,芋螺毒素干预组（30、60、120pmol）小鼠的白盒停留时间呈剂量-效应依赖性方式减少（Glu-Con-G:30pmol:386.2±50.2,P=0.000;60pmol:381.1±32.3,P=0.000;120pmol:362.3±25.4,P=0.000;Con-G:30pmol:430.0±15.7,P=0.006;60pmol:417.2±40.4,P=0.003:120pmol:379.5±12.0,P=0.000）。吗啡诱导CPP的复燃阶段,与溶剂对照组（NS-NS）相比,吗啡对照组（M-NS）小鼠白盒停留时间明显增高（分别为534.6±29.2和307.3±26.7,P＜0.05）,而芋螺毒素对照组（NS-G120,NS-C120）小鼠白盒停留时间均无显著性变化（P＞0.05）;同吗啡对照组（M-NS）相比,芋螺毒素干预组（30、60、120pmol）小鼠的白盒停留时间呈剂量-效应依赖性方式减少（Glu-Con-G:30pmol:331.2±34.0,P=0.000;60pmol:287.8±21.4,P=0.000;120pmol:282.9±54.3,P=0.000;Con-G:30pmol:352.7±32.2,P=0.000;60pmol:354.3±30.8,P=0.001:120pmol:339.7±40.0,P=0.000）。各组运动活性及探索行为指标间比较均无显著性差异。相关性分析结果表明,小鼠运动活性的评价指标——总运动距离和穿梭次数呈显著正相关,小鼠探索行为的评价指标两两之间呈显著正相关,而各组条件位置性偏爱同运动活性及探索行为无相关性。3.2小鼠前额叶皮质（PFC）和海马（Hp）脑区pSFKs（Tyr416）与总SFKs蛋白含量的变化CPP表达阶段:与溶剂对照组（NS-NS）相比,吗啡对照组（M-NS）和120pmolGlu-Con-G单次给药（NS-G120）小鼠PFC和Hp脑区pSFKs（Tyr416）蛋白含量均明显增加（P＜0.05）,总SFKs蛋白含量无明显差异;与吗啡对照组（M-NS）相比,60、120pmol Glu-Con-G引起成瘾小鼠PFC和Hp脑区p-SFKs（Tyr416）蛋白含量明显减少（P＜0.05）;但30pmol Glu-Con-G对成瘾小鼠PFC和Hp脑区p-SFKs（Tyr416）和总SFKs蛋白含量与吗啡对照组相比均无明显差异;30、60、120pmolCon-G均引起成瘾小鼠PFC脑区p-SFKs（Tyr416）蛋白含量明显减少（P＜0.05）;但Con-G仅在120pmol时引起成瘾小鼠Hp脑区p-SFKs（Tyr416）蛋白含量明显减少（P＜0.05）;而30、60pmol Con-G对成瘾小鼠Hp脑区p-SFKs（Tyr416）和总SFKs蛋白含量与吗啡对照组相比均无明显差异。CPP复燃阶段:与生理盐水对照组（NS-NS）相比,吗啡对照组（M-NS）与120pmol Glu-Con-G单次给药（NS-G120）小鼠PFC和Hp脑区pSFKs（Tyr416）蛋白含量以及120pmol Con-G单次给药组（NS-C120）小鼠Hp脑区pSFKs（Tyr416）蛋白含量均明显增加（P＜0.05）,总SFKs蛋白含量无明显差异;与吗啡对照组（M-NS）相比,60、120pmol Glu-Con-G和Con-G均引起成瘾小鼠Hp脑区p-SFKs（Tyr416）蛋白含量明显减少（P＜0.05）;但30pmol Glu-Con-G和Con-G对成瘾小鼠Hp脑区p-SFKs（Tyr416）和总SFKs蛋白含量与吗啡对照组相比均无明显差异;30、60、120pmol Con-G均引起成瘾小鼠PFC脑区p-SFKs（Tyr416）蛋白含量明显减少（P＜0.05）;但Glu-Con-G仅在120pmol时引起成瘾小鼠PFC脑区p-SFKs（Tyr416）蛋白含量明显减少（P＜0.05）;而30、60pmol Glu-Con-G对成瘾小鼠PFC脑区p-SFKs（Tyr416）和总SFKs蛋白含量与吗啡对照组相比均无明显差异。4结论1.单次侧脑室内分别给予30、60、120pmol Con-G或Glu-Con-G,可呈剂量-效应依赖性方式抑制吗啡成瘾小鼠CPP的表达和复燃;2.所给剂量的Glu-Con-G、Con-G均未显著影响正常小鼠和吗啡成瘾小鼠的运动活性和探索行为;3.长期吗啡处理可以引起成瘾小鼠PFC和Hp脑区p-SFKs（Tyr416）蛋白含量明显增加,总SFKs蛋白含量无明显差异;4.所给剂量的Glu-Con-G、Con-G均可降低吗啡成瘾小鼠PFC和Hp脑区p-SFKs（Tyr416）蛋白含量;5.单次侧脑室内给予120pmol Glu-Con-G可引起复燃同期对照组小鼠PFC和Hp脑区p-SFKs（Tyr416）蛋白含量明显增加,而相同剂量的Con-G仅引起Hp脑区p-SFKs（Tyr416）蛋白含量明显增加,总SFKs蛋白含量均无明显差异。