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目的：含有AZT相关突变位点的HIV对新药114的耐药机制研究方法：实验分为细胞内和细胞外两个部分。细胞内实验首先通过克隆产生野生型和含有突变位点病毒的质粒,其中突变位点包括T69SSS, M41L, T215Y, M41L/T215Y, M41L/L210W/T215Y, T69SSS/L210W/T215Y和T69SSS/M41L/L210W/T215Y。其次,制作大量野生型和含有突变位点的病毒,通过病毒感染含有荧光素酶的TAM-bl细胞,比较新药114与AZT,3TC, TDF对野生型和突变型病毒的抑制作用(IC50值)的差异。细胞外实验分为酶促动力学反应和引物延伸实验两个部分。首先构建含有的M41L/T215Y, M41L/L210W/T215Y, T69SSS, T69SSS/L210W/T215Y和T69SSS/M41L/L210W/T215Y的EPH质粒,通过细菌扩增产生大量逆转录酶。其次,通过NI-NTA提取法提取大量野生型和含有突变位点的逆转录RT酶,并通过FPLC法纯化蛋白。第三,酶促动力学反应,在没有ATP存在下,比较天然底物dTTP和NRTIs衍生物AZT TP、D4T TP、114TP之间的竞争性抑制作用。第四,引物延伸实验,加入生理浓度的ATP,比较在ATP存在下,野生型RT和突变型RT催化下,结合在引物上的AZT MP、D4T MP、114MP能否都被切除,探讨新药114与AZT, D4T在M41L/T215Y,M41L/L210W/T215Y, T69SSS, T69SSS/L210W/T215Y和T69SSS/M41L/L210W/T215Y这些突变位点的RT作用下,是否有相同的耐药机制。结果：1.细胞内实验通过琼脂凝胶电泳和基因测序结果证明,成功构建了野生型和含有AZT相关耐药位点HIV复制模型。3TC, AZT,114和TDF四种NRTIs类药物对野生型病毒都有很强的抑制作用,其中,是3TC的17倍,114的82倍,TDF的42倍。多重突变M41L/L210W/T215Y和T69SSS/M41L/L210W/T215Y对3TC有较强的耐药性,是野生型的20余倍；M41L/L210W/T215Y和T69SSS/M41L/L210W/T215Y对AZT耐药最明显,其耐药性分别升高126和1235倍；T69SSS突变和/或者合并有M41L、L210W、T215Y多重突变可以增强病毒对TDF20-48倍的耐药性；单一位点突变M41L和T215Y对114的耐药性基本无影响,而M41L/T215Y, M41L/L210W/T215Y和T69SSS/M41L/L210W/T215Y,耐药性分别升高13倍,13倍和25倍。与AZT,3TC和TDF相比,114对突变病毒的抑制作用最强。2.细胞外实验通过基因测序和酶活性测定证明,成功构建野生型和含有AZT相关突变位点的逆转录酶。酶促动力学部分,RT催化D/D反应的的活性是D/R4-8倍。酶促动力学参数Km值,当P/T为D/D和D/R时相比较,在D/R时Km值明显较小。竞争性抑制反应参数Ki值,P/T为D/R情况下明显小于P/T为D/D时,这与细胞内实验IC50值的结果一致。其中,114TP的Ki值最小,其次为AZT TP, D4T TP的Ki值最大,在野生型RT下,114TP与引物结合效率是AZT TP的2倍,是D4T TP的20余倍。引物延伸实验部分,在ATP存在下,加入AZT TP和114TP后,23bp产物基本没有变化；在没有ATP存在下,23bp产物基本逐渐减少。在ATP的存在下,结合在引物上的AZT MP,114MP和D4T MP在WT RT作用下,24bp产物基本没有变化,而M41L/L210W/T215Y和T69SSS/M41L/L210W/T215Y突变的RT催化下,24bp产物减少。结论：1.成功建立了野生型和含有AZT相关突变位点的HIV复制细胞模型体系；成功构建野生型和含有AZT相关耐药位点的HIV逆转录重组表达质粒。2.细胞内实验表明,3TC, AZT,114和TDF四种NRTIs类药物对野生型病毒AZT的抑制作用最强,对突变型病毒114的抑制作用最强。3.细胞外实验表明,RT催化下dTTP和AZT TP, D4T TP,114TP的竞争性抑制反应主要发生在逆转录过程；在没有ATP存在下,野生型与突变型RT对AZT TP,D4T TP和114TP与引物结合的效率没有影响；在ATP存在下,突变型RT对结合在引物上的AZT MP,114MP和D4T MP的有切除作用4.114对M41L/L210W/T215Y, T69SSS, T69SSS/L210W/T215Y和T69SSS/M41L/L210W/T215Y这些突变的耐药机制可能产生ATP依赖的焦磷酸解作用,结合细胞内实验结果,114对突变病毒仍有较强的抑制作用,提示114是潜在的抗HIV药物