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本研究建立了饲料中沙门菌的快速检测PCR和实时荧光PCR方法，进行了饲料中沙门菌的分离与鉴定，开展了沙门菌饲料分离株与活禽分离株耐药性比对及饲料分离株致病性风险评估。我国饲料中沙门菌的检测一直应用传统的微生物培养法检测，该方法检测周期长约5～7天，且操作步骤繁琐，应用试剂种类繁多，对疑似菌落的选取主观判断性强，易出现漏检，对检测人员技术水准要求较高。本研究以沙门菌菌属特异性基因invA基因为目的基因，利用分子生物学方法，建立了饲料中沙门菌的PCR检测技术和实时荧光PCR检测技术，克服了上述缺陷，将检测时间缩短至48小时，同时具有特异性好，灵敏度高，无假阴性，可操作性强，检测成本低等优点。PCR检测方法对饲料中沙门菌的检出限可达1～3CFU/25g，可检测的最低菌液浓度为3.2～4.0×102CFU/mL。本课题研究的PCR检测方法已通过国家标准化委员会的评审，现成为国家标准，于2012年11月正式发布实施（国标号为GB/T28642-2012）。在2008～2012年，我们对采自辽宁省的1221批饲料样品进行了沙门菌检测，同时应用本研究中建立的PCR方法和传统微生物方法检测，两种方法检测结果符合率为100%，共检出沙门菌14株，检出率为1.15%。经血清型鉴定，14株沙门菌共含有6个血清型，分别为姆班达卡沙门菌、汤卜逊沙门菌、雷根特沙门菌、阿柏丁沙门菌、斯坦利维尔沙门菌及乙型副伤寒沙门菌，其中有8株为姆班达卡沙门菌。以姆班达卡沙门菌进行毒力因子检测，结果为阴性。本方法在辽宁省饲料检测中心、河南省饲料检测中心、山东省饲料检测中心、吉林省兽药饲料监察所、农业部农产品检测中心（大连）以及沈阳市兽药饲料监察所等检测机构得到实际应用，在2009～2011年三年间，共检测饲料样品5352批，饲料原料935批，检出56批，检出率0.89%。证明本方法适用于饲料中沙门菌的检测。在普通PCR检测方法的基础上，研究建立的实时荧光PCR检测方法，省掉了凝胶电泳过程，进一步缩短了检测时间，灵敏度高于普通PCR约10倍，可检测每毫升含2.2×101cfu的菌液。本法检测所需时间为45小时，比常规PCR又缩短了3小时，进一步提高了检测效率。本研究建立的PCR和实时荧光PCR方法，经生产实践证明解决了饲料中沙门菌的快速、敏感、特异、准确检测的这一难题。本研究对分离的沙门菌进行了耐药性测定。同时对8株饲料中分离的沙门菌和3株本实验室分离的源自活禽体内的沙门菌进行了耐药性检测。选用13种临床常用药物。饲料源沙门菌对10种药物敏感，对临床常用的磺胺异恶唑和复方新诺明等产生耐药性。禽源沙门菌仅对3种药物敏感，对9种药物耐药性达100%。由此可见，饲料源沙门菌在临床上应该不足以造成大范围发病，也可认为活禽体内沙门菌的耐药性并非由饲料中沙门菌污染和传递，而与临床滥用抗生素药物有直接关系。对饲料中分离到的沙门菌进行致病性检测及风险评估。以6株姆班达卡沙门菌、1株汤卜逊沙门菌、1株雷根特沙门菌分别接种3日龄SPF雏鸡，同时设空日对照组。实验组雏鸡每只口服接种菌液0.1mL，浓度约为108cfu/mL,空白组以灭菌生理盐水代替。攻毒后观察6天，结果显示：实验组雏鸡除了具有轻微的临床症状和剖检病变外，试验雏鸡无死亡现象，且临床症状有好转趋势。为验证饲料中沙门菌毒力是否返强，取分离的姆班达卡沙门菌纯培养菌落制成0.5～5麦氏浊度的菌悬液，模拟自然感染过程，口服接种100μL于3日龄SPF雏鸡，并连续传代4次，每次实验期为7天，观察雏鸡临床症状、剖检变化及组织病变。结果显示：实验鸡没有死亡现象，但引起以肝脏和十二指肠为主的病变，并影响鸡只增重效果，感染鸡体重比空白组体重降低4.3%～10.7%。用相同剂量的菌液对试验鸡进行腹腔接种，其临床症状，剖检症状均比口服接种试验鸡症状严重。从传代结果分析，饲料源沙门菌致病力较弱，连续四代均无试验鸡死亡现象，随着传代次数的增加，致病性有增强趋势。可见，辽宁省饲料源沙门菌在家禽业中大面积流行或暴发的可能性不大。经饲料中分离到的沙门菌进行致病性检测及风险评估证实：某些血清型的沙门菌，虽没有强致死力，但却严重影响生产性能，降低经济效益，具有感染人的潜在风险。所以在生产中应尽可能避免将被沙门菌污染的饲料饲喂畜禽，加强饲料中沙门菌检测是非常必要的。本项研究具有如下特点：一是在国内首次将分子生物学方法应用于饲料中病原微生物的检测，并建立了《饲料中沙门菌的快速检测方法PCR法》和《饲料中沙门菌的实时荧光PCR检测方法》。二是本研究筛选出一种简便、快速、准确、灵敏度高的检测方法，在饲料源沙门菌的快速检测研究领域中处于国内领先水平。建立的《饲料中沙门菌的快速检测方法PCR法》和《饲料中沙门菌的实时荧光PCR检测方法》，其中《饲料中沙门菌的快速检测方法PCR法》已上升为国家标准，标准号为GB/T28642-2012。三是应用本研究建立的PCR方法和原国标方法（GB/T13091-2002饲料中沙门氏菌的检测）相结合，对辽宁省1221批饲料进行了沙门菌检测，共分离到沙门菌14株，共6个血清型。四是应用13种临床常用药物对本实验室分离并保存的8株饲料源沙门菌和3株禽源沙门菌进行耐药性检测，结果表明，饲料源沙门菌仅对3种药物耐药，而禽源沙门菌仅对3种药物敏感，对9种药物耐药率达100%。五是应用辽宁省地方沙门菌分离株对3日龄SPF雏鸡进行连继传4代进行攻毒实验，结果每批试验鸡均无死亡现象，但会出现肝脏及肠道病变，且增重缓慢，7天实验期后，对照组体重比实验组高出10%左右。