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组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1 (Histone lysine specific demethylase 1,LSD1)是2004年由Shi Yang教授课题组首次发现并证实的在多种肿瘤细胞中高表达的一个赖氨酸特异性去甲基化酶。TGF-β1 (transforming growth factor beta1,转化生长因子β1)和Wnt信号通路都参与了不同的组织细胞或功能器官的正常生长发育过程以及癌症的发生发展过程。本文研究LSD1对经典的TGF-β1和Wnt信号通路以及对EMT (epithelial-mesenchymal transition,上皮细胞-间质细胞转换)过程的影响。1)LSD1对TGF-β1表达的影响课题组前期在探索侵袭和转移机制研究过程中发现胃癌细胞MGC-803中TGF-β1正向调控LSD1的表达,而在胃黏膜上皮细胞GES-1中,TGF-β1对LSD1表达的调控作用并不明显。本课题将进一步探究LSD1对TGF-β1表达的影响,以期了解LSD1和TGF-β1在胃癌细胞及正常胃细胞中调控机制的异同。首先利用脂质体2000 (Lipofectamine(?) 2000, Lipo2000)和脂质体3000(Lipofectamine(?) 3000, Lipo3000)将构建好的LSD1过表达和干扰质粒转染细胞MGC-803和GES-1,然后用Elisa实验技术检测TGF-β1蛋白的表达：两株细胞中,LSD1低表达后TGF-β1蛋白表达均下调,LSD1过表达后TGF-β1蛋白表达均有所上调。同时进行ChlP-qPCR(染色体免疫沉淀,chromatin immunoprecipitation assay, ChIP;实时荧光定量PCR, Real-time Quantitative PCR, qPCR)实验检测两株细胞中LSD1低表达后LSD1和TGF-β1启动子区之间的结合,结果发现TGF-β1启动子区周围的H3K4me2和H3K9me2水平都升高,后者更明显。说明MGC-803中LSD1与TGF-β1之间的相互作用属于正相关调控,GES-1中二者作用与之不同。同时也证实了LSD1调控TGF-β1是与基因启动子附近的甲基化水平高低相关的。2)LSD1对Wnnt通路相关抑制因子和关键蛋白的表达影响前期文献研究表明,结肠癌细胞中LSD1可抑制Wnnt抑制剂DKK1的转录,从而激活Wnt通路。胃癌细胞中LSD1对Wnnt通路的调控机制尚不明确。本课题在细胞水平探讨研究胃癌发生发展过程中LSD1对Wnt/β-catenin通路中相关蛋白的调控作用及其机制。在慢病毒载体建立的LSD1 knockdown (KD)细胞系中利用qPCR实验检测到Wnt通路相关抑制因子SFRP1,2,4,5 (Secreted frizzled-related protein 1,2,4,5)、DKK1(Dickkopf1)、WIF-1 (Wnt inhibitory factor 1)和蛋白β-catenin的mRNA表达有明显变化。同时根据文献查找LSD1和Wnt通路相关抑制因子启动子区之间的结合联系,利用H3K4me2和H3K9me2抗体进行ChIP-qPCR实验检测LSD1低表达之后,发现Wnt通路相关抑制因子启动子周围的H3K4和H3K9甲基化水平有变化。结果说明了Wnt通路相关抑制因子的变化与其基因启动子附近的甲基化水平高低有一定相关性,但是具体的作用机制尚未明确。3)LSDl对Wnt蛋白和Wnt3a/β-catenin通路的作用在慢病毒载体建立的LSD1 KD细胞系MGC-803和GES-1中,利用Western Blot, Elisa实验检测Wnt3a的表达发现LSD1低表达影响Wnt3a的分泌。分别加入PORCN (Porcupine)抑制剂Wnt-C59和Wnt3 a/β-catenin通路抑制剂水飞蓟宾作用48 h,Western Blot检测相关蛋白的变化。MGC-803中Wnt-C59抑制LSD1低表达引起的Wnt3a分泌,Total β-catenin、p-β-catenin和Total LRP6几乎不变,加入水飞蓟宾,Total LRP6和Total β-catenin减少明显。GES-1中加入Wnt-C59并未抑制LSD1低表达引起的Wnt3a分泌,Total β-catenin和p-β-catenin不变,加入水飞蓟宾,Total LRP6和Totalβ-catenin的变化与MGC-803中不同。两株细胞中检测核内p-β-catenin发现同一时间点LSD1低表达或加入水飞蓟宾胞核中p-β-catenin的表达增加,不同时间点p-β-catenin先升高后降低。分析结果可知LSD1低表达影响Wnt3a分泌的同时抑制Wnt3a/β-catenin通路。4)LSD1低表达对EMT标志蛋白的作用课题组前期工作表明细胞MGC-803中LSD1促进EMT过程的发生,本课题注重探究LSD1低表达对EMT的影响,以及在细胞MGC-803和GES-1中的异同。在LSD1 KD细胞系MGC-803和GES-1中利用Western Blot检测EMT标志蛋白的表达变化,结果发现在MGC-803中E-cadherin上调明显,GES-1中EMT相关蛋白变化不大。说明MGC-803中LSD1对EMT进行正相关调控,GES-1中LSD1对EMT的调控并不明确。因此LSDl是否介导Wnt通路的EMT过程有待进一步研究。生命现象的调控具有复杂性,本课题将抗肿瘤新型靶点LSDl与研究较为成熟的TGF-β1通路和Wnt通路联系起来,进行相关蛋白的调控研究。其中LSD1 KD影响Wnt3a分泌抑制Wnt3a/β-catenin通路是新发现。同时对比了MGC-803和GES-1两株细胞中蛋白相互调控的异同,为抗肿瘤靶点研究提供了新的思路。