胶质瘤是中枢神经系统原发肿瘤中恶性程度最高的肿瘤之一,现有最有效的综合治疗方案为最大程度的手术切除加上术后的放疗和烷化剂化疗,却因肿瘤的侵袭性和对放化疗的抵抗而最终复发,胶质母细胞瘤(GBM)的中位生存期仅14个月左右。以往的研究已揭示胶质瘤的恶性进展依赖于多个分子和信号通路形成的网络,仅针对网络中的某一靶点进行干预效果极为有限,因此寻求能够调控多个与胶质瘤恶性进展相关的分子和信号通路的干预靶标,成为研究胶质瘤生物治疗的前沿热点。泛素蛋白酶系统(UPS)通过迅速降解蛋白质,来调节多种细胞生理过程,包括细胞增殖,生长,分化,凋亡衰老等。泛素酶系统包括泛素激活酶E1,形成并调节泛素分子链的泛素结合酶E2和直接与底物连接的泛素连接酶E3,E3连接酶直接决定泛素化调控的特异性,它主要包括APC(分裂后期促进复合物)和SCF(SKP1-CUL1-F-box复合物)这两大类型,而Fbw7(F-box and WD repeat domain-containing 7)则是SCF型E3连接酶的底物结合单位,其调控异常在所有泛素体系中最为常见。Fbw7参与降解的底物包括一系列已知的促癌因子,其中有一大部分是参与细胞恶性转化的转录因子和促癌信号通路上的蛋白分子,包括cyclin E,MYC,JUN,Notch等。Cyclin E与细胞周期激酶CDK2共同调节细胞从G1到S期的进程,对细胞增殖起到关键限速作用。作为细胞周期的重要调控因子,Cyclin E受到泛素蛋白酶系统的精确调控,其突变异常在肿瘤细胞中早已确认,过度激活的Cyclin E引起染色体基因组不稳定从而引发肿瘤。c-Myc也是控制细胞周期的关键转录因子,在许多恶性肿瘤中发现具有拷贝数扩增,基因转位等突变而导致表达水平升高,其转录活性参与调控细胞增殖、蛋白合成、凋亡、代谢以及细胞分化等生物过程;c-Jun是受丝裂原激活的API转录因子复合物的组份,在多种肿瘤细胞中呈组成性激活,发挥促进细胞增殖的效应;Notch是位于细胞膜的转录因子,其胞内区域被γ-分泌蛋白水解酶复合物切除成具有转录活性的成分,并进入细胞核发挥促进细胞分裂增殖以及抑制细胞成熟分化的作用。Fbw7因为对这些促癌分子的调控而成为最重要的抑癌基因。Fbw7在肿瘤中常见发生失活性突变,突变率从6%到35%不等,仅次于另外两个抑癌基因p53和PTEN。此外Fbw7基因转录后的自身调控在肿瘤中也多见异常,p53,SREBP2,NF-k B1,Pin1,RITA,MEK-ERK,以及micro RNAs等分子和通路的异常激活,有的可以从转录水平上(如NF-κB1),有的从翻译后磷酸化修饰层面(如ERK激酶)使得Fbw7的表达及活性下调,并最终导致其不能正常行使泛素连接酶的功能,从而致使正常生理情况下受到Fbw7泛素化调控的底物分子因降解受阻而逐渐在细胞中累积,或失去正常的随细胞分化、生长等特定生理行为而改变的表达节律。以细胞增殖为例,正常细胞从G1期过渡到复制期S期时,周期蛋白Cyclin E的表达水平会出现生理性逐渐增加,并在S期起始点达到峰值,在细胞完成G1/S过渡后即在转录负调控以及Fbw7介导的泛素蛋白酶降解作用下,在细胞中的表达水平逐步下降,而与促进DNA合成相关酶转录激活有关的Cyclin A表达开始增加,显而易见,当Fbw7的水平出现异常下调时,Cyclin E的功能持续激活,乃至不能受到细胞周期检验机制的约束,导致细胞周期蛋白的有序节律发生紊乱,DNA合成失常,形成单倍体、多倍体并引发恶性增殖。肿瘤的恶性生物行为还包括向周围组织浸润侵袭,乃至向远隔组织转移,以及肿瘤细胞的分化异常,比如肿瘤细胞出现表皮-间质转化以及干性化。在这些通路上的分子均可能因为Fbw7的表达异常和功能丧失而失去正常调控,这是我们研究Fbw7参与胶质瘤恶性生物行为的理论基础。就胶质瘤而言,临床疗效是我们更为关心的问题,由于胶质母细胞瘤的极高恶性程度,手术切除并不能从解剖上彻底根治肿瘤细胞,因此术后的同步放化疗和辅助化疗已成为胶质瘤综合治疗的金标准。替莫唑胺是二代烷化剂,是胶质瘤术后化疗中应用最为广泛的药物,它可以导致肿瘤细胞的DNA断裂,继发凋亡、自噬抑或衰老,最终导致细胞死亡。遗憾的是并非所有胶质瘤患者都对替莫唑胺敏感,其中不少患者对其不敏感,或在治疗过程中产生耐药而使肿瘤迅速出现进展和复发,显然这是肿瘤细胞对化疗药物的抵抗和耐药所致。我们课题组的前期研究已发现很多参与肿瘤细胞增殖、侵袭、凋亡机理的分子也同时参与了肿瘤细胞对化疗药物敏感性的调控,其中包括细胞膜药物转运蛋白的改变、凋亡和自噬的调控,DNA损伤的修复等机理的研究。上述这些与胶质瘤化疗耐药相关的机理中也存在大量Fbw7调节的靶点分子。这是我们研究Fbw7参与胶质瘤对化疗药敏感性改变的理论基础。有关Fbw7对胶质瘤细胞的生物作用以及在肿瘤对替莫唑胺敏感性中的调控机理尚缺乏全面深入的研究,因此本课题旨在研究FBW7对胶质瘤细胞的增殖、侵袭、迁移等生物行为的作用,肿瘤细胞对替莫唑胺敏感性的影响,并初步探讨其机理。课题共分四大部分,第一部分通过数据库查询和石蜡标本免疫组化染色,观察Fbw7在胶质瘤临床样本的表达,与病理级别及与患者预后的的关系;第二部分,构建Fbw7慢病毒过表达载体,在胶质瘤U251和U373细胞株中研究过表达Fbw7后对细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;第三部分,在替莫唑胺诱导的U251耐药株中检测Fbw7的表达改变,过表达Fbw7后耐药细胞对TMZ敏感性的影响,并观察体外过表达Fbw7联合TMZ治疗对胶质瘤细胞生长的影响;第四部分,研究Fbw7对细胞周期和凋亡的改变作用以及对下游底物Auroa B、Mcl-1及Notch1的调控作用,从而探讨其影响调控胶质瘤增殖、侵袭、迁移和对替莫唑胺敏感性的机制。第一部分Fbw7在胶质瘤临床样本中的表达与临床相关性研究目的:研究Fbw7在不同级别脑胶质瘤组织中m RNA及蛋白表达,分析Fbw7的表达水平与胶质瘤患者预后的关系。方法:查询TCGA数据库中基于基因芯片检测的m RNA信息和样本对应的病人生存期资料,比较Fbw7在高低级别胶质瘤中的m RNA水平,利用KM生存分析法和log-rank检验比较Fbw7表达水平和病人预后的关系,应用免疫组织化学染色检测Fbw7在50例(II级15例,III级10例,IV级30例)胶质瘤中的蛋白表达及细胞定位,对染色强度进行定量化后,利用秩和检验分析不同级别胶质瘤Fbw7的表达水平差异以及与增值标志Ki-67蛋白表达的关系。结果:Fbw7的m RNA水平在高级别胶质瘤中有明显下调,IV级胶质母细胞瘤与II级相比差异有统计学意义。m RNA水平按中位数上下分为低表达和高表达,生存分析显示两组表达水平的生存期长短有显著差异(P<0.05)。免疫组化示Fbw7蛋白表达主要分布在细胞核及细胞质,Fbw7染色水平随着肿瘤级别升高表达明显下降,且表达水平与Ki-67指数明显相关。结论:Fbw7的m RNA水平和蛋白水平均随胶质瘤病理级别的增高而下调;表达水平与患者的生存时间明显相关,与肿瘤增殖标志物Ki-67显著相关。第二部分Fbw7影响胶质瘤增殖、侵袭及迁移能力的体外研究目的:通过慢病毒载体靶向过表达Fbw7,研究Fbw7对胶质瘤U251和U373细胞增殖活力的影响,以及对细胞体外侵袭及迁移特性的影响。方法:构建Fbw7过表达慢病毒转染体系,在U251和U373细胞中过表达Fbw7,在细胞生长的不同时间点(24,48,72,96,120h)进行四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)检测细胞活力,绘制细胞时间-活力曲线,观察比较Fbw7对U251、U373细胞增殖活性的影响;同时利用集落形成实验观察Fbw7影响细胞生长形成克隆的能力。利用Transwell实验观察Fbw7转染后72小时,瘤细胞侵袭能力的改变。利用Wound healing划痕实验比较过表达Fbw7后18h及36h,细胞迁移能力受到的影响。结果:通过荧光定量和WB测定证实,成功构建Fbw7过表达慢病毒载体经MTT法检测,转染Fbw7慢病毒后细胞生长48小时开始,U251、U373细胞株的活性与空白及阴性转染对照组相比,有显著降低。培养3周后,转染Fbw7后,U251和U373细胞较之对照组细胞克隆(>20 cells)形成数量有明显减少(P<0.001)。Transwell实验结果显示,Fbw7慢病毒转染后72小时,U251及U373细胞的侵袭能力明显下降,且差异具有显著的统计学意义。细胞迁移实验中,我们在划线后18h和36h对两种细胞的迁移距离进行了测量,结果显示Fbw7过表达组的细胞迁移速度在这两个时间点上与空白及阴性对照相比均有明显减慢(p<0.001)。结论:过表达Fbw7对胶质瘤U251和U373细胞株的体外增殖和克隆形成能力有明显抑制;并且可以明显降低胶质瘤的侵袭及迁移特性。第三部分Fbw7影响胶质瘤细胞对替莫唑胺敏感性的体外研究目的:;分析Fbw7在替莫唑胺诱导U251耐药株的表达水平和对其耐药性的影响,以及过表达Fbw7对U251细胞TMZ敏感性的影响。方法:用TMZ浓度梯度递增诱导建立胶质瘤U251细胞耐药株,West Blot检测耐药株与其亲本株中Fbw7的蛋白表达差别。利用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)测定转染Fbw7前后U251耐药株对TMZ的耐药指数改变。最后采用MTT法研究Fbw7过表达与TMZ联合作用对U251细胞体外生长抑制的影响。结果:WB测得Fbw7在U251/TMZ细胞株中的相对表达低于U251对照。慢病毒转染Fbw7后,U251/TMZ细胞的IC50指数与U251亲本细胞株相比明显减低。体外活力抑制实验中,Fbw7转染+TMZ联合作用在36小时和72小时,较单用TMZ、单独Fbw7转染以及空白对照组,抑制率均显著降低。结论:U251耐药株的耐药性获得可能与细胞在药物诱导过程中自发下调Fbw7的表达水平有关;过表达Fbw7后U251/TMZ耐药株的耐药指数逆转。此外,Fbw7过表达则可以在体外增加TMZ对U251细胞的抑制率。第四部分Fbw7影响胶质瘤细胞恶性生物行为的机制研究目的:对Fbw7具体影响胶质瘤细胞体外增殖活性,侵袭迁移能力的机制进行研究,同时初步探讨Fbw7影响胶质瘤对替莫唑胺化疗敏感性的可能机制。方法:通过流式细胞术,检测转染Fbw7后U251胶质瘤细胞株的周期改变和凋亡情况,比较TMZ与Fbw7转染作用后72h,不同干预组的细胞周期和凋亡改变情况,以及相关周期、凋亡相关分子改变。Western Blot法分析比较在Fbw7过表达后24和72小时,以及不同干预方式作用细胞后72小时周期激酶Aurora B,以及凋亡分子Caspase 3、Mcl-1、转录因子Notch1的改变。结果:Fbw7转染U251细胞后72小时,流式细胞结果显示转染组联合TMZ治疗组,较对照组,单独Fbw7转染组,单独TMZ治疗组具有显著增加的G2/M期比率,以及显著减少的异倍体细胞比率。同时流式细胞凋亡检测显示在U251细胞中,Fbw7慢病毒转染联合TMZ治疗组的细胞凋亡率与对照组,单独Fbw7转染组,单独TMZ治疗组相比明显增加,差异有统计意义。WB结果显示,周期激酶Aurora B的表达在转染Fbw7 24和72小时点均低于对照U251细胞,并且转染组72小时点表达水平较24小时有进一步降低趋势;与此同时,凋亡效应分子Caspase 3在Fbw7转染细胞中的表达量高于对照,且72小时点含量略高于24小时点,而与此相反Fbw7过表达后抑凋亡分子Mcl-1表达水平且随时间逐步降低;进一步对转录因子Notch1蛋白的检测发现在Fbw7转染细胞后24和72小时,测得Notch1表达水平较空白组显著减少,且在24小时点的蛋白表达低于Aurora B和Mcl-1。在Fbw7转染U251细胞并联合TMZ作用后72小时,WB检测Aurora B表达较空白组和单独TMZ组下调,但单独TMZ组较空白组无明显改变;Caspase 3水平与流式凋亡结果一致,联合作用组较TMZ和对照组增加,而联合作用组Mcl-1表达则有明显降低,且单独TMZ组较空白组Mcl-1上调;Fbw7过表达联合TMZ作用72小时同样显著下调Notch1水平。结论:过表达Fbw7在体外实验中对胶质瘤细胞增殖、迁移侵袭能力的抑制以及对TMZ的增敏作用机制,可能是通过下调周期激酶Aurora B,凋亡抑制底物Mcl-1,转录因子Notch1,进而使G2/M阻滞细胞增加,异常分裂细胞减少以及促进瘤细胞凋亡。