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乙内酰脲酶是一类用于手性氨基酸生产的酶。本研究包括L-乙内酰脲酶和D-乙内酰脲酶两个部分研究。 建立了一个可行的筛选模型,从不同地区采集土样,利用5-对羟基苯基乙内酰脲为惟一氮源进行土样富集,在筛选平板上经过初筛后,获得49株候选菌株,通过检测中间产物和终产物进行复筛,结果筛选得到1株活性最强的产酶菌株BT821。该菌能将DL-对羟基苯基乙内酰脲不对称水解为D-对羟基苯甘氨酸。 通过化学合成和基因拼接方法获得了编码一种耐热D-乙内酰脲酶的基因,并对其活性做了初步研究,结果表明,该D-乙内酰脲水解酶活性在55℃下比在37℃时更高。 通过PCR获得编码硫氧还蛋白结构基因,置T5启动子之下,再连接至低拷贝质粒pOK12上,构建得到能够单独表达硫氧还蛋白且与pUC或pQE质粒相容的质粒。利用双质粒系统同时表达目的蛋白和伴侣分子硫氧还蛋白,可实现目的蛋白的可溶表达,减少包涵体形成。 通过PCR扩增得到BT811的D-乙内酰脲水解酶和D-氨甲酰化酶的结构基因,分别置于表达载体pT221(含有一种分子伴侣的质粒)的T7和pQE60的T5启动子下游构成表达质粒pT221-hyuH和pQE60-hyuC,并分别在大肠杆菌BL21(DE3)和JM109中实现了两个基因的表达。SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量53kD和45kD处分别有一表达带,与BT811的D-乙内酰脲水解酶和D-氨甲酰化酶的一级结构预测分子量53.0kD和45.2kDa相符。通过PCR扩增得到BT801 L-氨甲酰化酶的结构基因,将该基因置于原核表达载体pQE60的强启动子T5启动子控制之下,加上组氨酸标签,实现了该酶在大肠杆菌JM109中的表达,SDS-PAGE结果显示在44KD处有表达带,这与氨甲酰化酶的一级结构预测分子量相符(44413 D)。纯化了该酶,纯化后的酶是初始菌活性的144倍。用100mmol/L的NaHCO3和100μmol/L的Co2+对BT801的L-乙内酰脲水解酶进行了激活。