论文部分内容阅读
第一部分 甘草酸缓解异氟烷所致发育期大鼠认知功能障碍目的：探讨甘草酸能否通过作用于发育期大鼠海马HMGB1缓解异氟烷暴露所致发育期大鼠认知功能改变。方法：出生后7天(PND7)的大鼠,随机分为对照组(CON)、异氟烷组(ISO)、甘草酸组(Gly)及异氟烷+甘草酸组(ISO+Gly)。CON组和Gly组分别经腹腔注射生理盐水或甘草酸溶液30分钟后接受对照气体处理4小时,ISO组和ISO+Gly组分别经腹腔注射生理盐水和甘草酸溶液30分钟后接受1.8%异氟烷处理4小时。麻醉结束后对四组实验动物立即行左心室采血进行血气分析,各组大鼠每组随机选取5只于麻醉结束后0、6、12和48小时分离及取出海马组织。采用蛋白印迹杂交(Western blot)技术,检测异氟烷暴露及甘草酸作用对发育期大鼠海马中HMGB1蛋白表达的影响,其余各组大鼠在麻醉结束后24天(PND31)接受水迷宫训练并进行测试,以评估异氟烷暴露及甘草酸作用对发育期大鼠认知功能造成的影响。结果：①血气分析结果显示,pH值、PaC02、Pa02、血糖值及Sa02均在生理范围内(P>0.05)。②Western Blot检测结果显示,与对照组相比,异氟烷组大鼠海马中HMGB1表达量出现上调,并于麻醉结束后12小时表达量达到峰值(P<0.05)。给予甘草酸后异氟烷暴露导致海马中HMGB1表达上调得到有效抑制(P<0.05)。③Morris水迷宫测试结果显示,与对照组相比,异氟烷组大鼠出现认知功能异常的表现：逃避潜伏时间和运动轨迹延长(P<0.05),平台穿越次数减少(P<0.05),并且上述变化均可被甘草酸作用逆转和减轻(P<0.05)。结论：异氟烷作用可导致发育期大鼠海马HMGB1蛋白表达量升高。甘草酸作用可缓解异氟烷暴露所致海马HMGB1蛋白表达水平增高并减轻发育期大鼠的认知功能损伤。第二部分甘草酸可缓解海马炎症反应减轻异氟烷所致发育期大鼠海马突触功能障碍和细胞凋亡目的：探讨甘草酸对异氟烷暴露诱发的发育期大鼠海马神经炎症反应、突触功能障碍及神经元凋亡的影响。方法：将出生后7天(PND7)的大鼠随机分为对照组(CON)、异氟烷组(ISO)、甘草酸组(Gly)及异氟烷+甘草酸组(ISO+Gly)。CON组和Gly组大鼠分别在腹腔注射生理盐水或甘草酸溶液30分钟后接受对照气体处理4小时,ISO组和ISO+Gly组分别腹腔注射生理盐水和甘草酸溶液30分钟后接受1.8%异氟烷处理4小时。于麻醉结束后12小时分离并提取海马组织蛋白进行蛋白印迹杂交(Western blot)检测,以比较异氟烷及甘草酸作用前后海马中 Bcl-2、Bax、cleaved (active) caspase-3,突触功能蛋白PSD-95、SNAP-25和炎症相关因子以及NF-κB通路相关蛋白表达量的变化;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测海马中炎症因子IL-1p,TNF-α表达量变化。结果：①Western Blot结果显示,甘草酸作用可减弱异氟烷暴露所致发育期大鼠海马cleaved (active) caspase-3和促凋亡蛋白Bax表达量上调,并且有效减弱异氟烷暴露所致的海马中抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.05)。此外,甘草酸作用可逆转异氟烷暴露对海马PSD-95SNAP-25蛋白表达量的下调作用(P<0.05)。②ELISA结果显示甘草酸可抑制异氟烷暴露导致的海马IL-1β,TNF-α表达上调。③Western Blot结果显示,异氟烷暴露可上调细胞核内NF-κB p65蛋白表达量(P<0.05),同时导致细胞质内NF-κB及IκBα蛋白表达量下调(P<0.05),甘草酸作用后可有效减弱上述变化(P<0.05)。结论：甘草酸可有效抑制异氟烷暴露所诱发的发育期大脑内细胞凋亡并抑制突触蛋白PSD-95及SNAP25表达量下调,甘草酸还可减弱异氟烷暴露诱发的发育期大脑内促炎症因子表达增加,此外,NF-κB通路可能参与上述变化。第三部分甘草酸通过调节CX3CL1/CX3CR1通路缓解异氟烷所致海马神经元凋亡和炎症反应目的：探讨甘草酸通过调节CX3CL1/CX3CR1信号通路缓解异氟烷所致发育期大鼠海马神经元凋亡和炎症反应。方法：①在体实验：将出生后7天(PND7)的大鼠随机分为对照组(CON)、异氟烷组(ISO)及异氟烷+甘草酸组(ISO+Gly).。CON组大鼠在腹腔注射生理盐水30分钟后接受对照气体处理4小时,ISO组和ISO+Gly组大鼠分别经腹腔注射生理盐水和不同剂量甘草酸溶液30分钟,后接受1.8%异氟烷处理4小时。对照组和异氟烷组大鼠在麻醉结束后0h,6h,12h和48h分离海马组织,通过Western blot检测海马中CX3CL1和CX3CR1的蛋白表达变化,麻醉结束后12h时检测对照组(CON)、异氟烷组(ISO)及异氟烷+不同剂量甘草酸组(ISO+Gly)海马CX3CL1表达变化。②离体实验：原代神经元体外培养5-7天后,将其随机分为5组：(1)对照组(CON)：接受对照气体(空气)暴露4小时;(2)异氟烷(ISO)组：接受1.8%异氟烷暴露4小时；(3)甘草酸组(Gly)：神经元培养基中加入终浓度为100μM的甘草酸,30分钟后接受对照气体暴露4小时；(4)异氟烷+甘草酸组(ISO+Gly)：神经元培养基中加入终浓度为100μM的甘草酸溶液,30分钟后接受1.8%异氟烷暴露4小时;(5)异氟烷+甘草酸+抗CX3CR1抗体组(ISO+Gly+anti-CX3CRI):于神经元培养基中加入终浓度为100μM的甘草酸和1μg/ml anti-CX3CR1抗体,干预30分钟后接受1.8%异氟烷暴露4小时。麻醉结束后2h取上层培养基进行检测,ELISA检测培养基中CX3CL1,IL-1β和TNF-α的表达水平变化,TUNEL检测神经元凋亡水平,Western blot检测HMGB1及磷酸化Akt的表达变化。结果：①异氟烷麻醉后发育期大鼠海马CX3CL1表达水平逐渐下降,于6小时后最低,并在之后48小时内逐渐恢复(P<0.01)。而CX3CR1的表达并不受到异氟烷麻醉的影响(P>0.05)。(②10、20、30 mg/kg的甘草酸均能显著缓解异氟烷导致的发育期大鼠海马CX3CL1表达水平下降(P<0.01或P<0.05)。③离体实验结果表明,甘草酸可缓解异氟烷暴露所致的海马神经元凋亡、CX3CL1释放减少及1L-1β、TNF-α释放增加(P<0.0 I或P<0.05),而这些作用都能被CX3CR1抗体拮抗(P<0.01)。结论：甘草酸可能通过调节CX3CL1/CX3CR1信号通路缓解异氟烷暴露所致发育期大鼠海马神经元凋亡和炎症反应。