谷类中淀粉含量占种子总重量的90%以上,因此淀粉的积累对于作物产量和品质的形成具有极为重要的意义。淀粉的形成是一个复杂且精密的过程,需要许多酶类和调控因子的参与,最终淀粉在造粉体内被转化为淀粉颗粒并储存起来。这一模型已经初步建立,但随着越来越多该模型外的粉质基因的发现,建立新的多网络交叉模型就显得尤为重要。为寻找淀粉合成相关的新基因,我们对实验室已有的日本晴T-DNA插入突变体库进行了筛选,从中筛到了一个粉质突变体,命名为flo7,细胞学观察发现位于胚乳外周的造粉体发育受到影响。通过图位克隆和转基因互补的手段,成功克隆了FLO7基因,它编码一个含364个氨基酸的未知功能的蛋白。生物信息学预测结果表明其N端含有一个质体转运肽,C端含有一个未知功能结构域1338(DUF1338)。亚细胞定位结果证实FLO7存在于造粉体基质中。组织表达分析显示FLO7在水稻中是组成型表达的,在胚乳中表达量最高,且特异地在胚乳外周表达。体内与体外蛋白实验表明突变后的蛋白稳定性下降。具体研究结果如下:1.突变体flo7成熟种子不透明,横截面观察显示主要是胚乳外围粉质。扫描电镜结果表明,flo7胚乳外围淀粉颗粒变圆,排列比较疏松。与野生型相比,flo7灌浆速率降低,千粒重只有野生型的87%左右。突变体种子生理生化测定结果显示,蛋白质和氨基酸含量显著下降,脂肪含量提高44.3%,支链淀粉聚合度也发生了明显改变。2.透射电镜观察结果表明,随着胚乳的发育,突变体造粉体中的淀粉颗粒能够正常的变大,但是不能紧密排列,淀粉颗粒之间存在空隙,造粉体的填充速率降低。半薄切片观察结果显示在胚乳发育中期,突变体胚乳中复合淀粉颗粒碎裂,不能形成紧密排列的多边形。这些结果说明FLO7对于水稻胚乳中正常复合淀粉颗粒形态的形成起着关键的作用。3.将突变体flo7与籼稻品种培矮64配制杂交组合。利用F2群体将突变基因定位在第10染色体长臂标记Z5和Z24之间的83 kb内,经过RGAP网站预测该区间含有16个基因,基因组测序发现只有基因Os10g0463800内部存在一个单碱基的替换,造成RNA水平上剪切紊乱,蛋白翻译提前终止。功能互补结果证实Os10g0463800即为我们寻找的控制造粉体发育的目标基因,将其命名为FLO7(Floury Endosperm7)。它编码一个包含364个氨基酸的未知功能的蛋白质,在水稻中是单拷贝的,从低等植物到高等植物都是很保守的。该蛋白在N端有一个质体定位信号肽,同时C端含有一个未知功能结构域1338(DUF1338)。4.荧光定量PCR结果显示,FLO7在根、茎、叶、叶鞘、穗子和胚乳中都有所表达,在胚乳中表达量最高。不同灌浆时期中FLO7蛋白含量随着种子的发育逐步积累增多。GUS组织染色和定量结果一致。原位杂交结果显示,FLO7主要在胚乳的外围表达。由此可以推断突变体的表型是由FLO7在胚乳中的特异性表达决定的。5.亚细胞定位研究证明FLO7 N端的信号肽对其正确定位到叶绿体起着关键作用。在水稻转基因植株中,FLO7蛋白被定位于胚乳造粉体的基质中。综合以上结果,FLO7蛋白对造粉体的发育确实起着至关重要的作用。通过连续观察野生型蛋白与突变体蛋白在烟草叶片中的表达情况,发现与野生型相比,突变体蛋白的稳定性下降。相同的实验结果在水稻原生质体系统中被再次验证。因此C端缺失的氨基酸对于FLO7蛋白的稳定积累是必需的。同时利用荧光定量PCR的方法检测了淀粉合成相关基因在野生型和突变体flo7胚乳中的表达情况,这些基因的表达基本没有发生太大变化。酶谱分析结果表明,参与淀粉合成的相关酶类也未受到影响。这些数据表明突变体flo7中淀粉的合成过程并未受到影响。