论文部分内容阅读
本论文的目的是介绍并验证神经网络电兴奋性定量测试的新方法——电压阈值测定法（Voltage Threshold Measurement Method,VTMM）:首先基于微电极阵列（Microelectrode arrays,MEA）生物传感器构建了PC12类神经元、大鼠海马神经元和大鼠海马区脑片三种类型的神经芯片,并在此基础上介绍并验证了新型电压阈值测定法,然后采用该方法研究了乙酰胆碱（ACh）、酒精（EtOH）和温度（T）三种不同因素作用下三种神经网络电兴奋性的变化规律。接着,本论文采用高内涵技术（High Content Screening,HCS）,对PC12类神经元网络和大鼠海马神经元网络中细胞在上述三种因素作用下神经网络中细胞的存活率、神经细胞突起长度和面积、ROS和Ca2+含量进行了研究,并分析了上述细胞分子生物学指标在三种影响因素作用下的变化规律。最后,本论文进一步对VTMM和高内涵细胞技术研究结果进行联合分析,研究了在三种外界因素作用下,PC12类神经元网络和大鼠海马神经元网络中细胞的细胞分子生物学指标与阈值电压(VTh)之间的相互关系,讨论了三种因素影响神经网络电兴奋性变化的相关分子机理。本论文主要实验结果如下:1)PC12类神经元网络、大鼠海马神经元网络和大鼠海马区脑切片的标准阈值电压(Normal VTh)分别为36、56和31 mV;2)三种神经网络的阈值电压均与乙酰胆碱浓度成反比关系;当培养液中乙酰胆碱浓度（单位:μg/mL）分别增至8（PC12）、6（海马神经元）和4（海马区脑切片）时,三种神经元网络的阈值电压都减小到0mV。在乙酰胆碱作用下,PC12类神经元网络和海马神经元网络的细胞存活率、突起长度、突起面积、ROS含量和Ca2+含量均未出现显著性变化;乙酰胆碱对神经网络电兴奋性影响的相关分子机理大致为:首先乙酰胆碱作用于接头或突触后膜上的胆碱能受体,激活了多种离子通道及腺苷酸环化酶系统,不仅改变了包括Ca2+在内多种离子的含量,影响了细胞膜电位等,也提高了“钠带”等的活性,最终使神经网络兴奋性上升,阈值电压下降。3)三种神经网络的阈值电压均与酒精浓度成指数率关系;当培养液中酒精浓度（单位:mmol/L）分别高于80（PC12）、110（海马神经元）和120（海马区脑切片）时,三种神经网络均不再具有电兴奋性。在酒精作用下,PC12类神经元网络和海马神经元网络中细胞的存活率没有显著性变化;两类神经元网络中细胞的突起长度和面积均呈极显著性下降、ROS和Ca2+含量均呈极显著性上升（海马神经元网络中细胞的ROS含量呈显著性上升）;酒精对神经网络电兴奋性影响的相关分子机理大致为:一方面直接导致突起长度和面积降低,使“钠带”活性受到抑制;另一方面促使Ca2+快速超载,导致突起长度和面积减少,同时Ca2+的快速超载也使ROS快速累积,进一步加重突起长度和面积的减少,并直接抑制“钠带”活性。最后使神经网络兴奋性受抑制,阈值电压上升。4)三种神经网络的阈值电压与培养基温度（单位:℃）的关系都呈现为“U”形曲线,即从37℃向下,都随培养基温度降低而升高,从37℃向上,随培养基温度升高而迅速降低,当培养基温度分别降低至33（PC12）、33（海马神经元）和32（海马区脑切片）℃时,或者分别增加至42（PC12）、43（海马神经元）和44（海马区脑切片）℃时,三种神经网络失去电兴奋性;相比较降低培养基温度,阈值电压受培养基温度升高的影响较小。在不同培养基温度作用下,两类神经网络中细胞的存活率均出现先升后降的趋势,但整体变化并不显著;从37℃开始升高培养基温度至42℃,两类神经网络中细胞的突起长度均呈显著性下降,突起面积均呈极显著性下降,ROS和Ca2+含量均呈极显著性增加;从37℃开始降低培养基温度至33℃,两类神经元网络中细胞的突起长度和面积均未发生显著性变化,而ROS和Ca2+含量均呈极显著性上升（PC12类神经元网络中细胞的ROS含量呈显著性上升）。温度对神经网络电兴奋性影响的相关分子机理大致为:（1）降低温度一方面降低了Ca2+的含量,直接抑制了神经兴奋性,同时造成了ROS含量的降低。最后,Ca2+和ROS含量的减少,共同造成了“钠带”等的活性下降,神经网络兴奋性受到抑制,阈值电压升高。（2）提高温度一方面造成Ca2+含量的上升,Ca2+含量的上升不仅直接干扰神经兴奋性,也加重ROS的积累;另一方面造成ROS含量的快速累积,干扰“钠带”等的活性,并加重Ca2+含量的上升;最终,高温物理效应的直接干扰及Ca2+和ROS的超载,共同造成了突起长度和面积的减少及“钠带”等的活性上升,神经网络兴奋性上升,阈值电压下降。本论文研究表明:1)电压阈值测定法（VTMM）是一种能定量测评神经网络电兴奋性的准确、简便而又高效的新方法,可以用于研究环境（温度等）、食物（酒精等）和药物（乙酰胆碱等）等不同因素对神经网络电兴奋性的影响规律;2)VTMM方法能够,在与细胞电兴奋性相关分子指标发生显著性变化之前,准确而定量地检测到待测因素对神经网络的影响,灵敏且非常有效;3)三种神经网络均存在阈值电压,且阈值电压在不同种类及同种不同浓（强）度外界因素作用下均会发生相似的规律性变化。阈值电压的大小及阈值电压受外界因素影响而减小至0或增大至正无穷时外界因素的作用浓（强）度因神经网络种类的不同而不同。