论文部分内容阅读
缺氧与许多临床疾病有关,也是高原、高空、深水等特殊环境中常见的一种致病因素。虽然不同类型细胞对缺氧的敏感性不同,但是,随着缺氧程度和持续时间的增加,最终都会引起细胞代谢和功能障碍,甚至导致细胞死亡。神经细胞强烈依赖有氧代谢进行能量供应,对缺氧特别敏感,因而容易因为缺氧受到损伤。寻找促进神经元对低氧产生耐受的机制,对临床相关疾病的预防和治疗有非常重要的意义。近年来有研究显示,缺氧预处理可以保护神经元对后继发生的严重缺氧或其它致死性应激产生耐受,因此,缺氧预处理的神经保护作用受到越来越多学者的关注。尽管多种机制和分子被报道可能参与缺氧预处理的神经保护作用[1],但是这些分子最终怎样发挥保护作用还不确定,没有一个清晰系统的预适应机制受到普遍认可。缺氧诱导因子可被多种损伤因素诱导,也可调控许多信号途径,是介导缺氧信号与众多缺氧诱导基因转录激活的一个重要调控因子,可通过使细胞适应低氧环境,发挥促进细胞生存的重要作用。有关缺氧诱导因子及其调控基因/产物功能及作用的研究已经成为当前的热点和前沿[2, 3]。针对缺氧诱导因子及其调节基因/产物在缺氧预处理中的作用和机制,目前有许多有争议的报道[4, 5]。如有研究显示,HIF-1的表达增加在缺氧预处理中可能具有非常重要的作用。然而,亦有文献报道缺氧预处理通过抑制HIF-1活性产生保护作用。还有报道显示,缺氧预处理不依赖HIF-1的途径产生保护作用。因而,缺氧诱导因子及其调节基因/产物在缺氧预处理中的作用仍不清楚,有待进一步研究。CoCl2是常用的缺氧模拟化合物,CoCl2预处理可产生与缺氧预处理相似的神经保护作用[6]。本课题通过分化的神经型SH-SY5Y细胞建立CoCl2化学缺氧预处理的神经型细胞保护模型,对缺氧诱导因子1、2及其调节基因VEGF、GLUT-1、EPO、LDH-A等在CoCl2预处理中的作用进行初步的探讨,并通过应用重组人VEGF和可抑制VEGF活性的VEGF抗体,对缺氧诱导基因产物VEGF的缺氧保护作用进行研究。主要的实验方法、结果和结论如下:方法1.人神经母细胞瘤SH-SY5Y常规培养于含15 %胎牛血清(FCS)的MEM/F12(1:1体积比)培养液,10μmol/L维甲酸(RA)诱导细胞分化3-7d后用于实验。2.分化的SH-SY5Y细胞随机分为对照组、化学缺氧预处理组(细胞先用50μmol/LCoCl2预处理3 h,换液后常氧培养1 h,然后在2%的低氧孵箱内缺氧28 h)、缺氧组(2%的低氧孵箱内缺氧28 h)。或将分化的SH-SY5Y细胞随机分为对照组C (常氧培养);化学缺氧预处理组HP(细胞先用75μmol/L CoCl2预处理1.5 h,换液后常氧培养3 h,然后用250μmol/LCoCl2化学缺氧24 h);化学缺氧组H(250μmol/LCoCl2化学缺氧24 h)。通过乳酸脱氢酶释放率测定、MTT细胞活力测定判断上述各组细胞的损伤程度。3. RT-PCR测细胞的VEGF、GLUT-1、EPO、LDH-A的mRNA表达。4.用Western Blotting法测细胞VEGF的蛋白表达。5.分化的SH-SY5Y细胞随机分为对照组、化学缺氧预处理组(细胞先用50μmol/LCoCl2预处理3 h,换液后常氧培养1 h,然后在2%的低氧孵箱内缺氧28 h)、化学缺氧预处理+VEGF抗体组(细胞加40μg/ml VEGF单克隆抗体,其余同化学缺氧预处理组)、缺氧组(2%的低氧孵箱内缺氧28 h)、缺氧+VEGF组(细胞加100 ng/ml VEGF纯品,其余同缺氧组)。通过MTT比色法测各组细胞的活力。6.用Western Blotting法测细胞HIF-1α、HIF-2α蛋白表达。结果1.化学缺氧预处理组细胞较化学缺氧组细胞活力显著增高(P<0.05),乳酸脱氢酶释放率显著减少(P<0.05)。2.化学缺氧预处理组细胞较常压缺氧组细胞活力显著增高(P<0.05),乳酸脱氢酶释放率显著减少(P<0.01)。3.化学缺氧预处理组细胞GLUT-1、EPO mRNA表达显著高于缺氧组(P<0.05),VEGFmRNA表达显著高于缺氧组(P<0.01),LDH-AmRNA表达在两组之间没有显著性差异。4.化学缺氧预处理组细胞VEGF蛋白表达显著高于缺氧组(P<0.01)。5. MTT细胞活力测定显示40μg/mlVEGF单克隆抗体可抑制化学缺氧预处理的保护作用,而100 ng/ml重组人VEGF可模拟化学缺氧预处理组的保护作用。6.化学缺氧预处理组细胞HIF-2α蛋白表达显著高于缺氧组(P<0.01),HIF-1α蛋白表达在两组之间没有显著性差异。结论1.通过乳酸脱氢酶释放率和MTT分析,建立了CoCl2化学缺氧预处理抵抗CoCl2化学缺氧的神经型细胞模型。2.通过乳酸脱氢酶释放率和MTT分析,建立了CoCl2化学缺氧预处理保护神经型细胞对常压缺氧产生耐受的预处理模型。3. CoCl2化学缺氧预处理抵抗常压缺氧的效果较CoCl2化学缺氧预处理抵抗CoCl2化学缺氧的效果更强。4.化学缺氧预处理可能通过促进缺氧调节基因GLUT-1、EPO、VEGF的表达而产生保护作用。5. VEGF在化学缺氧预处理中具有非常重要的保护作用。6.化学缺氧预处理可能通过HIF-2,而不是HIF-1,促进包括VEGF在内的缺氧调节基因表达产生耐缺氧的保护作用。