背景与目的乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染呈全球性分布,全球约有20亿人既往感染过HBV,目前全球仍有超过3.5亿的慢性乙肝病毒感染者。中国是HBV感染高发地区,2006年中国乙型肝炎流行病学调查结果表明,我国乙肝表面抗原(HBsAg)携带率约为7.18%,其中约2000万例为慢性乙型肝炎患者(Chronic hepatitis B virus, CHB),这些患者可以发展为失代偿性肝病、肝硬化、原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)等危及患者生命的疾病,因此HBV仍然是我国重要的社会公共问题之一。拉米夫定因具备有效的抑制HBV的复制的能力成为第一个用于慢性乙型肝炎治疗的核苷(酸)类似物。CHB患者在LAM长期治疗下可以显著降低CHB患者血清HBV DNA水平,促进HBeAg血清学转换的发生,降低肝脏炎症活动,从而延缓或阻止肝脏疾病的进展,减少失代偿肝硬化和肝癌的发生,降低CHB患者的死亡率。由于其良好的安全性和耐受性,成为许多经济欠发达地区首选用于治疗慢性乙型肝炎的药物。目前耐药成为阻碍LAM长期治疗的主要原因,耐药在LAM治疗下的1年、2年、3年、4年和5年的发生率分别为22%、38%、53%、66%和82%。耐药发生后可导致病毒学突破或反弹,加重疾病进展,增加肝硬化以及肝癌发生的风险。因此拉米夫定治疗过程中乙肝病毒耐药的监测以及及时的挽救治疗是至关重要的。拉米夫定耐药后的挽救治疗,目前指南推荐主要是换用TDF或加用ADV。拉米夫定耐药后加用ADV比换用ADV疗效更好,并且可以减少ADV耐药的发生率,因此指南主要推荐的拉米夫定耐药的挽救治疗策略是加用无交叉耐药的核苷(酸)类药挽救物。但这种挽救治疗策略将意味患者需要接受长达多年的药物治疗,而且可能会导致多重耐药的发生。聚乙二醇干扰素a-2a (Pegylated Interferon alfa-2a, Peg-IFNa-2a)是一种长效干扰素,疗效优于普通干扰素。Peg-IFN α-2a可以通过有限的治疗时间在部分患者中诱导持续的免疫应答,如持续的HBeAg血清学转换,甚至HBsAg血清学转换。因此有研究提示Peg-IFN a-2a可能用做LAM耐药的挽救治疗。为了评价Peg-IFN a-2a挽救治疗LAM耐药患者的治疗疗效,在2005年至2008年间,我们进行了一项多中心、随机、对照临床研究。此项临床研究用于评价Peg-IFN a-2a在HBeAg阳性的拉米夫定耐药患者疗效和安全性。结果显示Peg-IFN a-2a在LAM耐药患者的疗效与其在初治患者疗效相比,应答不佳的比例偏高,在48周停药后,大部分患者发生了病毒学反弹。Peg-IFNαt-2a治疗LAM耐药患者应答与疗效并未令人满意,挽救治疗应答不佳的原因并不清楚,主要由宿主免疫和病毒两方面的因素导致,而这两个因素之间又存在相互作用的关系。HBV以准种形式存在于感染者体内,感染者体内的HBV准种因自身的突变及复制能力的差别和宿主免疫压力的选择作用下发生着不断的变化,而在核苷(类)药物的作用下,HBV耐药突变毒株的变化可能主要由药物的选择和病毒自身适应性决定,但在Peg-IFN a-2a治疗下并不存在对于病毒耐药位点的选择,因此在Peg-IFN a-2a治疗下耐药突变毒株变化可能更能反应宿主免疫与病毒自身适应性的变化,而目LAM耐药患者在Peg-IFN a-2a治疗下耐药毒株的动态变化和演变尚无报道。近年来,焦磷酸测序分析的方法越来越多的应用于生物医学检测。该方法由于高灵敏度、准确性以及高通量的特点,也逐渐被开发应用于HBV耐药突变的检测。本研究采用的基于焦磷酸测序设计的试剂盒,其可检测10个常见HBV耐药突变相关位点(rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236和rt250)。所以,首先我们对焦磷酸测序试剂盒进行了性能及临床适用性的评价,随后通过焦磷酸测序定量检测Peg-IFN a-2a治疗过程中LAM耐药患者耐药毒株的动态变化,并研究耐药毒株的演变与治疗疗效的关系。研究对象与方法一、 标本来源1.焦磷酸测序试剂盒临床验证标本及标准品102例CHB患者临床样本选自2011年1月至2011年12月在南方医院肝病中心住院或门诊的病人。CHB诊断符合2005年慢性乙型病毒性肝炎防治指南相关标准；患者使用NA治疗时间>6个月；在治疗期间发生病毒学突破(HBVDNA水平较最低点上升1个log值)或生化学突破,或经过1年以上的抗病毒治疗后HBV DNA仍然高于检测下限(≥1000 copies/ml);在南方医院肝病中心通过PCR联合Sanger测序分析检测HBV耐药,成功获得HBV RT区序列的患者。焦磷酸测序特异性检测采用的是中国药品生物制品检定所提供的HBV核酸定量标准品中的阴性参考品。PCR最低检测下限验证采用世界卫生组织HBVDNA定量标准品。含乙型肝炎病毒基因序列rt区片段、10个耐药相关突变位点(rt169、rt173、 rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236和rt250)均为野生型或突变型的质粒由凯杰生物工程(深圳)有限公司提供。2.研究LAM耐药毒株的演变及其与治疗疗效的关系的标本本研究中的所有患者均来自2005年至2008年进行的一项多中心、随机、对照临床试验。此项临床试验在中国13个研究中心进行,其中包括香港。研究开始时共255例患者进入随机分组,其中聚乙二醇干扰素a-2a治疗组171例,阿德福韦治疗组84例。根据其应答情况,本研究首先通过40例患者分析peg-IFN治疗下耐药毒株动态状态及其与治疗应答关系,其中13例患者发生完全应答,27例无应答患者通过年龄、性别、基线HBV DNA水平、基线HBsAg水平和HBV基因型与完全应答患者进行配对。而后,将所有24周血清量足够的123例聚乙二醇干扰素a-2a治疗患者用于验证24周耐药毒株定量与应答关系。二、 实验技术1.核酸提取使用QIAamp UltraSens Virus Kit从200 μL血清样本中提取40 μL核酸样品,提取步骤严格按照试剂盒的说明书进行,并在提取过程中采取必要措施防止样本间的交叉污染。2.焦磷酸测序使用Qiagen公司提供的焦磷酸测序试剂盒可检测10个常见HBV耐药突变相关位点：rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236和rt250。扩增使用Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR分析仪,焦磷酸测序平台为PyroMark(?) Q24 MDx (Qiagen,德国),测序步骤严格按照试剂盒的说明书进行。三、测序数据分析采用焦磷酸测序仪配套的分析软件,首先进行单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)分析判定是否有突变。若该位点存在杂合突变,则进行突变株的比例分析,判断突变病毒株在病毒准种中所占的比例,再通过后期线性关系计算出真实突变比例。四、焦磷酸试剂盒验证1.PCR最低工作下限使用WHO乙型肝炎病毒核酸定量标准品梯度稀释系列样品验证试剂盒PCR工作下限。2.线性范围及准确性评价使用含乙型肝炎病毒基因序列rt区片段的10个耐药相关突变位点均为野生型或均为突变型的2个质粒样品制备不同突变型/野生型比例的系列样品,重复检测至少10次用于评价试剂盒的准确性及建立突变比例真实值与检测值的线性关系。3.焦磷酸测序与直接测序对比选取102例经Sanger测序分析rt区序列的核苷(酸)类药物治疗慢性乙型肝炎患者临床样本,使用焦磷酸测序试剂盒检测分析10个HBV耐药相关突变位点的特征,评价两种测序分析结果的一致性。五、临床指标检测方法1.血清HBV标志物的检测使用商业化的试剂盒,检测方法为Abbott Architect 12000免疫化学发光法。2.血清HBV DNA定量PCR荧光定量探针法,使用使用商业化的试剂盒Cobas Amplicor HBV Monitor V2.0检测,检测下限为60 IU/mL。3.ALT使用商业化的试剂盒,通过全自动生化检测仪检测,正常值上限为40U/L。六、数据统计本文中所有数据均使用SPSS 19.0统计软件进行分析。计量资料以平均值±标准差或中位数(范围)表示,率的比较用卡方检验或Fisher确切概率检验分析。定量资料用两独立样本非参检验的Mann-Whitney U检验进行分析。阳性预测值、阴性预测值、特异性、敏感性和ROC曲线下面积用来检验预测因子预测预后的相应预测价值,线性关系评价采用线性拟合,所有结果均采用双侧检验,P<0.05为差异具有统计学意义。结果一、焦磷酸测序试剂盒验证焦磷酸测序试剂盒的PCR工作下限为50 IU/mL；线性分析提示除rt236位点外,其他9个耐药位点的突变比例真实值与检测值线性关系均达到R2>0.98；临床样本检测结果显示,4例样本部分位点PCR扩增失败,98例样本HBV DRT检测结果与Sanger测序分析结果的总符合率达92.6%(897/969),其中10个耐药相关突变位点结果全部一致的样本占46.9%(46/98)；两种测序方法在1 0个位点上的一致率介于71.5%至100%；两种测序结果不一致中,87.5%(63/72)为Sanger测序结果为野生型(WT)而HBV DRT检测结果为野生／突变混合型(WT/MT),6.9%(5/72)为Sanger测序结果为WT而HBV DRT检测结果为MT,5.6%(4/72)为Sanger测序结果为WT/MT而HBV DRT检测结果为WT。二、LAM耐药毒株的演变及其与治疗疗效的关系1.焦磷酸测序结果共123例Peg-IFN a-2a治疗组患者纳入分析,首先40例用于分析拉米夫定耐药动态变化的患者在0周、24周、48周、72周的焦磷酸测序成功率为100%(40/40)、82.5%(33/40)、70%(28/40)和87.5%(35/40)。随后检测了123例患者24周耐药突变情况用于验证其与疗效关系,检测成功率为91%(112/123)。2.患者基线临床特征。共123例Peg-IFN a-2a治疗组患者纳入分析,其中101例为男性,22例为女性,中位年龄为33岁(19～63岁),血清HBV DNA水平为7.15±1.2 log IU/mL,ALT水平为72U/L (9～1776 U/L)。其中34例为基因B型,89例为基因C型。3.基线耐药突变40例患者中M204V/I、L180M、A181V和V173L各位点上发生突变的人数占总人数百分比分别为100%(40/40)、82.5%(33/40)、60%(24/40)和10%(4/40),该四位点在患者体内突变比率中位数分别为95.8%(29.6%-100%)、80.5%(0%-97.1%)、5.9%(0%-16.8%)和0%(0%-97%)。4. Peg-IFN a-2a治疗下耐药毒株变化情况rtM204V/I总突变百分率在完全应答组(CR)的0周、24周、48周和72周分别为91.3±19.4%、19.9±27.1%、9.1±26.4%和15.8±27.4%；无应答组(NR)的0周、24周、48周和72周分别为90±11.3%、47.2±32.2%、31.2±29.4%和21.3±29.9%。rtL180M突变百分率在CR组的0周、24周、48周和72周分别为50+44.6%、11.2±27.1%、13.6±23.9%和13.4±25.5%；NR组的0周、24周、48周和72周分别为69.4±32.4%、31.2±29.6%、11.66±29.7%和9.2±18.9.%。rtA181V突变百分率在CR组的0周、24周、48周和72周分别为5.8±5.9%、1.3±1.3%、1.0±2.1%和2.3±2.2%；NR组的0周、24周、48周和72周分别为6.0±5.2%、4.6±2.8%、4.5±3.7%和5.3±3.2%。5.基线耐药毒株突变百分率与治疗疗效关系基线rtM204V/I平均突变比率在CR组和NR组无显著统计学差异(91.3±19.4% vs 90±11.3%,P=0.132)。基线rtLl 80M平均突变比率在CR组和NR组无显著统计学差异(50+44.6%vs 69.4±32.4%P=0.307)。基线rtA181V平均突变比率在CR组和NR组无显著统计学差异(5.8-±-5.9%vs4.6±2.8%P=0.311)。6.24周耐药毒株突变比率与Peg-IFN治疗应答的关系24周M204V/I、L180M和A181V等位点在CR组和NR组之间均有统计学差异(P均<0.01)。40例患者24周时HBV DNA、HBsAg、M204V/I、L180M和A181V对于治疗应答的预测的ROC曲线下面积分别为0.866、0.872、0.771、0.781和0.862。全部123例患者的24周时HBV DNA、HBsAg、M204V/I、L180M和A181V对于治疗应答的预测的ROC曲线下面积分别为0.809、0.833、0.672、0.759和0.764。7.24周预测完全应答的最佳cut-off值HBV DNA、HBsAg、M204V/I、L180M和A181V在24周预测完全应答的最佳cut-off值分别为6 log IU/mL、 2log IU/mL、20%、5%和5%。结论1.焦磷酸试剂盒用于检测乙肝耐药基因具有良好的敏感性和准确性,在检测样本中存在少量病毒突变株时优于直接测序,可用于耐药突变的早期检测。2.基于本研究数据,我们并未发现基线病毒耐药毒株突变百分率与治疗疗效的关系,基线时完全应答组和无应答组在M204V/I、L180M、A181V等三位点的耐药毒株突变百分率无统计学差异,基线病毒耐药毒株突变百分率并不能预测治疗应答。3.24周耐药毒株突变比率水平的高低可预测Peg-IFN治疗拉米夫定耐药患者的疗效,在全部123例患者M204V/I、L180M和A1 81V对于治疗应答的预测的ROC曲线下面积分别为0.672、0.759和0.764。但预测作用最强的仍是HBV DNA和HBsAg水平。4.24周时,耐药毒株突变比率水平结合HBV DNA和HBsAg水平可增强预测效能,当HBV DNA<6 log10 IU/mL, HBsAg<2 log10 IU/mL且rtA1 81V<5%时,其预测敏感度为84.62%,特异度为81.48%,阳性预测值(PPV)为68.75%,阴性预测值(NPV)为91.67%。提示在使用聚乙二醇干扰素对拉米夫定耐药进行挽救治疗可定量检测突变水平来增加预测效能。