论文部分内容阅读
番茄白粉病是由新番茄粉孢菌（Oidium neolycopersici,On-Lz）引起的番茄生产上危害严重的一种真菌病害,但是番茄抗白粉病机制尚不完全清楚。真核生物中,信号转换通常是由小G蛋白调控的,通过结合GTP的活化形式和结合GDP的非活化形式影响下游效应因子进而调控多种信号传导和代谢等过程。在小G蛋白中,来源于植物与Rho家族具有高度同源性的蛋白组成了植物特有的一类小GTP结合蛋白,即Rop家族。Rop家族的下游肌动蛋白相关蛋白ARP2/3复合体是肌动蛋白微丝骨架动力学的主要调控因子,与植物多种细胞学过程相关,包括对生物胁迫的响应。因此,研究小G蛋白ShROPs与微丝骨架聚合因子ShARPCs介导的植物免疫机制,对全面了解小G蛋白以及微丝骨架参与的免疫机制,以及进一步阐明番茄和白粉菌互作的分子机理具有重要意义。本研究以模式作物番茄和拟南芥作为主要研究对象,主要通过生物信息学、病毒诱导基因沉默、高效液相色谱、烟草瞬时过表达、拟南芥突变体回补、拟南芥过量表达、亚细胞定位、qRT-PCR、酵母双杂交、酵母突变体回补等试验方法,对小G蛋白ShROP1、ShROP11基因以及微丝骨架聚合因子ARP2/3复合体亚基ShARPC3、ShARPC5基因在番茄与白粉菌互作中的功能进行研究,并筛选与ShROP1、ShROP11互作的蛋白。主要研究结果如下:1.生物信息学分析表明小G蛋白ROP1的氨基酸序列具有高度保守性。ShROP1主要定位在细胞膜和细胞质中。和番茄MM（Moneymaker）-白粉菌亲和互作体系相比,非亲和互作的番茄LA1777（Solanum habrochaites）在接种白粉菌后,ShROP1基因能够显著上调表达。在番茄LA1777植株上沉默ShROP1基因接种后,沉默植株的抗病性明显降低。HPLC分析沉默株中的SA（Salicylic acid）激素含量显著减少。组织学观察表明番茄植株沉默ShROP1基因和拟南芥rop1突变体接种后均能减少寄主细胞过敏性坏死（HR）以及H2O2积累量。由此说明ShROP1可以诱导植物产生HR和H2O2抵抗病原菌侵入,且在烟草上瞬时过量表达能够快速产生过敏性坏死,预示ShROP1可能介入了ETI防卫反应。也可以通过依赖内源信号分子SA的传递途径调节植物的抗病反应,从而激活下游抗病相关蛋白PR1和PR3基因的表达破坏病原菌的细胞结构。2.番茄ShROP11主要定位在细胞膜和细胞核中。ROP11基因在番茄LA1777与白粉菌非亲和互作中表达量显著高于番茄MM与白粉菌亲和互作。利用VIGS技术沉默ShROP11后,番茄LA1777对白粉菌On-Lz的抗性降低。和对照相比,沉默株接种后产生较少的HR和H2O2。HPLC分析沉默株中的脱落酸含量显著升高。在拟南芥rop11突变体上异源过量表达ShROP11基因能够恢复拟南芥的抗病性。由此说明ShROP11作为一个正调控因子参与番茄对生物胁迫的响应,通过诱导植物产生HR和H2O2来抑制病原真菌的侵入。此外,ShROP11可以通过依赖内源信号分子ABA的传递途径防御病原菌侵入,且抑制SA激素信号通路。3.利用酵母双杂交GAL4系统验证ShROP1与ShProfilin、ShROP1与ShCHI9蛋白互作。ShROP1可能通过和Profilin蛋白互作调节下游肌动蛋白的聚合参与植物的PTI途径。ShROP1也可以通过和ShCHI9蛋白互作通过破坏病原菌的细胞壁结构从而抑制病原菌生长。并且证实ShROP11分别与ShCHI3和ShNP24蛋白互作。ShROP11通过与ShNP24蛋白互作调控抗病原菌物质的产生,从而参与番茄抗病的PTI途径。ShROP11也可以通过和ShCHI3蛋白互作通过破坏病原菌的细胞壁从而防御侵染。这些结果为ShROP1和ShROP11蛋白的免疫功能提供了结构基础依据。4.番茄LA1777植株上的ShARPC3基因编码ARP2/3复合体的一个亚基蛋白。ShARPC3编码的174个氨基酸的蛋白包含一个保守的P21-ARC结构域。沉默ShARPC3能够增加植物对番茄白粉病菌的感病性,说明了ShARPC3在植物防卫信号中的作用,并且沉默ShARPC3导致SA介导的防卫信号途径受阻,同时SA信号分子下游的病程相关蛋白PR1、PR2和PR3基因表达显著下调。相反,在拟南芥上异源过量表达ShARPC3后接种On-Lz,能够通过诱导产生过敏性坏死和活性氧增加植物的抗病性。此外,ShARPC3在酿酒酵母arc18突变体上异源表达能够在温度胁迫下回补生长表型。总之,ShARPC3在番茄上通过植物免疫的正向调节作用对On-Lz做出响应。5.生物信息学分析表明番茄ARP2/3复合体亚基ShARPC5含有一个保守的P16-ARC结构域,并且与拟南芥、烟草等亲缘关系较近。VIGS试验表明ShARPC5通过诱导番茄产生ROS和HR响应On-Lz生物胁迫,并且能诱导病程相关蛋白PR1基因的表达。相反,在拟南芥上异源过量表达ShARPC5能够增加植株对On-Lz的抗病性。此外,ShARPC5也参与植物对非生物胁迫的响应。说明Arp2/3复合体在病原菌侵染过程中参与抗病作用。