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研究背景结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是一种常见的致死性肿瘤。80%的CRC属于散发性结直肠癌(sporadic colorectal cancer,sCRC),从结肠腺瘤发展成结肠腺癌往往要经过很多年。CRC在早期是完全可以被治愈的,但是目前针对早期CRC筛查的的遗传分子标志物仍然不够完善。CRC是涉及多个基因的多个常见及罕见突变的复杂疾病,是一种具有高度遗传异质性的复杂疾病,不同的患者可能具有不同的基因突变,因此需要针对更多的患者针对不同的基因进行突变筛查,以期发现与CRC发生相关的新的候选基因。本研究前期通过三例无家族病史的CRC患者的癌组织进行全外显子组测序,发现一例SARDH基因17号内含子与18号外显子的剪接位点发生突变,而该患者的癌旁组织则无此突变。目前发现的很多经典的癌症相关基因在癌组织中都具有一定的突变概率,并且SARDH基因的干扰被证实与前列腺癌细胞的侵袭能力有关,我们猜想SARDH基因可能是一个sCRC发生发展相关的基因。目前SARDH基因的表达与癌症的临床相关性及其在癌组织的突变情况未见报道,其对癌细胞增殖及其迁移能力的影响及其机制尚不清楚。研究方法1,通过免疫组化在126例sCRC组织及癌旁组织中检测分析SARDH蛋白表达情况。通过实时定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)分析了 28对sCRC组织及癌旁组织的SARDH的mRNA水平。通过TCGA数据库分析CRC组织的SARDH的mRNA水平的变化。通过全外显子组测序及深度外显子测序技术在53例sCRC组织及癌旁组织中筛查SARDH基因的编码区域的可能的致病突变。2,构建SARDH过表达载体及SARDH干扰的sh-RNA载体,通过CCK8细胞增殖实验研究SARDH对CRC细胞增殖能力的影响;通过细胞迁移及侵袭实验检测SARDH对CRC细胞系迁移及侵袭能力的影响;通过裸鼠体内成瘤实验检测SARDH对CRC细胞系在裸鼠体内成瘤能力的影响。3,通过 Targetscan、Miranda、MiRDB 及 RNAhybrid 预测 SARDH3 ’-UTR 区域可能的具有调控作用的miRNA结合位点。通过双荧光素酶报告实验、实时定量及western blot实验确定可以负调控SARDH表达的miRNA。4,通过转录组测序(RNA-seq)技术结合基因共表达分析及信号通路分析确定与SARDH共表达的关键基因,通过UCSCxena数据库分析SARDH基因与差异表达基因的甲基化状态的相互关系。揭示SARDH参与CRC发展的相关通路及其可能的分子机制。研究结果1,免疫组化结果显示,与癌旁组织相比,sCRC组织中SARDH蛋白表达水平明显降低,SARDH基因的表达在sCRC患者不同的性别、年龄、CRC临床分期及淋巴结转移分组间未见显著性差异。RT-PCR检测结果显示,sCRC组织中SARDH的mRNA水平明显低于癌旁组织。外显子测序及深度测序结果显示,53例sCRC组织中共有1例癌组织特有的选择性剪接突变、1例癌组织特有的错义突变。2,细胞增殖实验结果显示,SARDH的过表达明显抑制了 HT29及SW480细胞系的增殖能力,SARDH的抑制则促进了 SW480及HCT116细胞系的增殖能力。细胞周期实验结果显示,SARDH的敲除明显促进了 SW480和HCT116细胞周期进程。Transwell迁移及侵袭实验结果显示,过表达SARDH的SW480细胞组的迁移及侵袭个数明显低于对照组;SARDH的抑制则显著增强SW480及HCT116细胞系的迁移及侵袭能力。裸鼠成瘤实验结果显示,SARDH的过表达减慢了 HT29细胞在裸鼠体内的成瘤能力,其瘤体重量及体积明显低于对照组,差异具有显著地统计学意义。3,Targetscan、Miranda、MiRDB 及 RNAhybrid 预测结果显示,miR-4651、miR-4297、miR-6508的种子区都与SARDH基因的3’-UTR区域完全互补,并且其结合的最小自由能均较低。实时定量、western blot结果显示仅miR-4651可以明显抑制SARDH基因的表达;双荧光素酶报告实验结果显示,相比于SARDH3’-UTR的突变型质粒,miR-4651可以明显降低3’-UTR野生型质粒的萤火虫萤光素酶活力,差异具有显著地统计学意义。4,通过RNA-seq技术结合GO分析、差异表达基因分析及RT-PCR验证发现,SARDH 的过表达下调了 CXCL1,CXCL10,CX3CL1,CCL5,CCL20,PMSB8,PMSB9,CD74,IFNL2的转录水平。基因共表达分析确定CXCL1基因是与SARDH基因相关性最高的基因,并且通过RT-PCR检测发现,在28例sCRC组织及其癌旁组织中CXCL1的表达与SARDH基因都呈现显著的负相关(P<0.05)。通过UCSC xena数据库分析结果显示,在CRC病人SARDH的转录水平与CXCL1和CCL20基因的甲基化状态呈现明显的正相关。结论1,SARDH在sCRC组织的表达明显下调。2,sCRC组织中SARDH的表达下调可能与sCRC组织中的SARDH基因编码区的突变相关,也可能受到miR-4651的负调控。3,SARDH可以抑制CRC细胞的增殖、迁移及侵袭能力。SARDH的抑制则促进CRC细胞的增殖、迁移及侵袭能力。4,SARDH可能通过抑制CXCL1为主的趋化因子信号通路来抑制CRC的发生。这种抑制作用可能是通过促进CXCL1和CCL20基因的甲基化而实现的。上述结果提示,SARDH是与sCRC发生发展相关的抑癌基因,其低表达参与了sCRC发生发展。