目的:克隆ERα基因,构建重组质粒,诱导表达ERα蛋白,预处理后免疫Balb/c小鼠,制备ERα单克隆抗体,研究其在免疫组化上的应用效果,制备具有免疫组化诊断价值的ERα单克隆抗体。方法:培养ERα高表达的T47D细胞,提取总RNA,用PCR技术扩增ERα基因,通过酶切、酶连方法构建pET-27b-ERα重组质粒。重组质粒转化至Rosetta表达菌中,IPTG诱导蛋白表达。用亲和镍柱分离纯化ERα重组蛋白。EDTA抗原修复液热修复蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。通过细胞融合技术制备杂交瘤细胞,采用ELISA和免疫组化相结合的方法进行单抗的筛选和评估。运用亚型鉴定试剂盒通过ELISA法测定单抗亚型。腹水诱导制备单抗并用重力层析柱纯化抗体,SDS-PAGE检测抗体纯度。运用免疫组织化学检测技术评估单抗的应用价值。结果:1、成功提取总RNA,pET-27b-ERα重组质粒构建成功,0.5mMIPTG诱导6h后大量表达分子量约为27KDa的ERα蛋白。2、3次免疫后Balb/c小鼠血清效价均达到1.25 X105。EDTA抗原修复液预处理组的免疫组化结果优于未处理组,预处理组ERα抗体的核定位更清晰、准确。3、ERα杂交瘤细胞融合成功,2次克隆化培养后获得2株免疫组化结果显示为核定位清晰、无背景染色和非特异性染色的单克隆细胞株,即2G10G4和2G10G12。重力层析柱纯化后抗体重链亚型均为IgG1,轻链亚型为κ型。结论:构建的ERα基因可成功制备抗原,通过免疫小鼠后制备单克隆抗体,筛选获得特异性强、亲和力高的ERα单克隆抗体,其在免疫组化检测中具有良好的效果。EDTA抗原修复液热修复ERα蛋白有利于制备应用于免疫组化的特异性抗体。