论文部分内容阅读
大肠杆菌(Escherichia coli)是一种在自然界和动物肠道内广泛存在，极易造成食品污染的革兰氏阴性菌。本研究以大肠杆菌ATCC43889为试材，通过对ATCC43889经不同的热胁迫反复处理和不同培养温度长时胁迫处理，研究对ATCC43889菌体胁迫是否能够诱导其对致死性高温环境的抗性。系统深入地研究了抗热性ATCC43889生理特性的变化及其抗热性机制，进一步为热杀菌技术在食品工业中的应用奠定理论基础。
研究大肠杆菌ATCC43889经50℃、60℃和70℃反复多次热胁迫处理，在10℃、28℃、36℃和45℃生长培养后对高温条件抗性的影响。分别对ATCC43889进行50℃、60℃和70℃的热胁迫，研究D50℃、D60℃和D70℃值的变化，观察ATCC43889热胁迫前后菌落形态和个体形态的变化；将ATCC43889置于10℃、28℃、36℃和45℃条件下培养至稳定期，分别测定其在50℃、60℃、70℃、80℃和90℃下的存活。试验结果表明，50℃、60℃和70℃热胁迫处理均可诱导ATCC43889抗热性增加；在80℃下，ATCC43889的致死曲线表明，胁迫温度越高，其抗热性越强(P＜0.05)；在10~45℃下培养，随着培养温度的升高，ATCC43889的抗热性显著增加(P＜0.05)。利用Weibull模型可以较好地拟合ATCC43889的抗热性曲线，随着胁迫温度和培养温度的升高，ATCC43889的抗热性都呈增加趋势。
经过热胁迫诱导后，ATCC43889菌落形态和个体形态与对照组相比差异显著，经50℃热胁迫后，部分菌株由球状体变为长杆状；经60℃热胁迫后的菌株个体形态较50℃热胁迫处理的菌株细长；经70℃热胁迫处理后大量的菌株聚集在一起，菌体表面呈凹凸不平的无规则形态。研究结果说明，一定的热胁迫可诱导大肠杆菌ATCC43889形态的变化。
在不同热胁迫和培养温度条件下，研究ATCC43889细胞膜脂肪酸组成和膜状态的变化。本研究提取了不同热胁迫和不同培养温度下大肠杆菌ATCC43889的细胞膜脂肪酸与磷脂，对其进行气相色谱与差示扫描量热仪分析；采用微量酶标板法测定了各菌株生物被膜生成能力的强弱。结果表明，与对照菌株相比，经过50℃、60℃和70℃各10次热胁迫处理并转接10次培养的菌株，缺失了3种脂肪酸，而在10℃、28℃和45℃下培养的菌株缺失了2种脂肪酸；随着热胁迫温度和培养温度的提高，热胁迫菌株细胞膜中饱和脂肪酸(SFA)及其总含量升高，而不饱和脂肪酸(USFA)及其总含量降低，ATCC43889抗热性菌株细胞膜磷脂的熔点(Tm)升高，表明细胞膜磷脂的相变温度升高，细胞膜流动性降低，菌体抗热性越强。随着热胁迫温度的提高，ATCC43889抗热性菌株的生物被膜生成活力增大，3种抗热性菌株的生物被膜生成能力与对照组相比差异显著(P＜0.05)。
对ATCC43889进行不同热胁迫和培养温度处理，研究外膜蛋白表达水平的变化。研究结果表明，随着胁迫温度的升高，分子质量在63kDa和75kDa附近的条带颜色逐渐变深，经60℃和70℃10次热胁迫并转接培养后所得的2种抗热性菌株在48~75kDa之间均增加了特异条带；胁迫温度越高，其特异性外膜蛋白表达量及其种类增加；随着培养温度的升高，分子质量在35~75kDa之间的外膜蛋白条带颜色逐渐变深，说明这两种分子量之间的外膜蛋白表达量显著提高，培养温度越高，其特异性外膜蛋白表达量越高，ATCC43889的抗热性越强。
研究ATCC43889在热胁迫过程中基因表达水平的变化。通过分析大肠杆菌ATCC43889原始菌株与抗70℃ATCC43889菌株的转录组数据，对比研究差异基因表达的变化。利用IlluminaHiSeq2500对热胁迫处理前后的ATCC43889进行了测序，通过Cufflnks、Cluster等相关软件对差异表达基因(DEGs)进行注释、筛选和分类。结果显示，以阈值为2倍来筛选差异表达基因，差异基因总数为650个，其中381个上调基因，269个下调基因。GO富集分析结果显示，分别有643条差异表达基因注释到生物学过程、分子功能和细胞组分的3个一级分类和22个二级分类；KEGG代谢途径分析结果表明，分别有296个基因归到106个代谢通路中。ATCC43889菌株高表达热激蛋白相关基因，暗示抗70℃的ATCC43889菌株可能通过增强热激蛋白的合成来阻止高温对细胞的损害；ATCC43889菌株高表达缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和赖氨酸等氨基酸合成与转运相关基因，表明抗70℃的ATCC43889菌株可能增加细胞内缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和赖氨酸的含量以应对不利的热胁迫环境；ATCC43889菌株高表达脂肪酸合成与代谢相关基因，通过改变细胞膜的流动性和通透性来保护其免受70℃热胁迫的伤害。热胁迫引起ATCC43889基因发生明显变化，这些基因共同作用减少热处理对细胞的损伤作用。本研究为大肠杆菌的抗热性机制研究提供了重要信息，为进一步揭示生物体适应机制奠定了基础。
研究大肠杆菌ATCC43889经50℃、60℃和70℃反复多次热胁迫处理，在10℃、28℃、36℃和45℃生长培养后对高温条件抗性的影响。分别对ATCC43889进行50℃、60℃和70℃的热胁迫，研究D50℃、D60℃和D70℃值的变化，观察ATCC43889热胁迫前后菌落形态和个体形态的变化；将ATCC43889置于10℃、28℃、36℃和45℃条件下培养至稳定期，分别测定其在50℃、60℃、70℃、80℃和90℃下的存活。试验结果表明，50℃、60℃和70℃热胁迫处理均可诱导ATCC43889抗热性增加；在80℃下，ATCC43889的致死曲线表明，胁迫温度越高，其抗热性越强(P＜0.05)；在10~45℃下培养，随着培养温度的升高，ATCC43889的抗热性显著增加(P＜0.05)。利用Weibull模型可以较好地拟合ATCC43889的抗热性曲线，随着胁迫温度和培养温度的升高，ATCC43889的抗热性都呈增加趋势。
经过热胁迫诱导后，ATCC43889菌落形态和个体形态与对照组相比差异显著，经50℃热胁迫后，部分菌株由球状体变为长杆状；经60℃热胁迫后的菌株个体形态较50℃热胁迫处理的菌株细长；经70℃热胁迫处理后大量的菌株聚集在一起，菌体表面呈凹凸不平的无规则形态。研究结果说明，一定的热胁迫可诱导大肠杆菌ATCC43889形态的变化。
在不同热胁迫和培养温度条件下，研究ATCC43889细胞膜脂肪酸组成和膜状态的变化。本研究提取了不同热胁迫和不同培养温度下大肠杆菌ATCC43889的细胞膜脂肪酸与磷脂，对其进行气相色谱与差示扫描量热仪分析；采用微量酶标板法测定了各菌株生物被膜生成能力的强弱。结果表明，与对照菌株相比，经过50℃、60℃和70℃各10次热胁迫处理并转接10次培养的菌株，缺失了3种脂肪酸，而在10℃、28℃和45℃下培养的菌株缺失了2种脂肪酸；随着热胁迫温度和培养温度的提高，热胁迫菌株细胞膜中饱和脂肪酸(SFA)及其总含量升高，而不饱和脂肪酸(USFA)及其总含量降低，ATCC43889抗热性菌株细胞膜磷脂的熔点(Tm)升高，表明细胞膜磷脂的相变温度升高，细胞膜流动性降低，菌体抗热性越强。随着热胁迫温度的提高，ATCC43889抗热性菌株的生物被膜生成活力增大，3种抗热性菌株的生物被膜生成能力与对照组相比差异显著(P＜0.05)。
对ATCC43889进行不同热胁迫和培养温度处理，研究外膜蛋白表达水平的变化。研究结果表明，随着胁迫温度的升高，分子质量在63kDa和75kDa附近的条带颜色逐渐变深，经60℃和70℃10次热胁迫并转接培养后所得的2种抗热性菌株在48~75kDa之间均增加了特异条带；胁迫温度越高，其特异性外膜蛋白表达量及其种类增加；随着培养温度的升高，分子质量在35~75kDa之间的外膜蛋白条带颜色逐渐变深，说明这两种分子量之间的外膜蛋白表达量显著提高，培养温度越高，其特异性外膜蛋白表达量越高，ATCC43889的抗热性越强。
研究ATCC43889在热胁迫过程中基因表达水平的变化。通过分析大肠杆菌ATCC43889原始菌株与抗70℃ATCC43889菌株的转录组数据，对比研究差异基因表达的变化。利用IlluminaHiSeq2500对热胁迫处理前后的ATCC43889进行了测序，通过Cufflnks、Cluster等相关软件对差异表达基因(DEGs)进行注释、筛选和分类。结果显示，以阈值为2倍来筛选差异表达基因，差异基因总数为650个，其中381个上调基因，269个下调基因。GO富集分析结果显示，分别有643条差异表达基因注释到生物学过程、分子功能和细胞组分的3个一级分类和22个二级分类；KEGG代谢途径分析结果表明，分别有296个基因归到106个代谢通路中。ATCC43889菌株高表达热激蛋白相关基因，暗示抗70℃的ATCC43889菌株可能通过增强热激蛋白的合成来阻止高温对细胞的损害；ATCC43889菌株高表达缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和赖氨酸等氨基酸合成与转运相关基因，表明抗70℃的ATCC43889菌株可能增加细胞内缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和赖氨酸的含量以应对不利的热胁迫环境；ATCC43889菌株高表达脂肪酸合成与代谢相关基因，通过改变细胞膜的流动性和通透性来保护其免受70℃热胁迫的伤害。热胁迫引起ATCC43889基因发生明显变化，这些基因共同作用减少热处理对细胞的损伤作用。本研究为大肠杆菌的抗热性机制研究提供了重要信息，为进一步揭示生物体适应机制奠定了基础。