A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)感染诱导机体产生过度炎症反应,尤其在肺部产生“细胞因子风暴”,其具体机制尚未明确。前期本实验室有研究表明,流感病毒与Cullin-1相关的E3连接酶复合物(CRL1)之间存在互作,且与产生炎性细胞因子的NF-κB通路密切相关。本研究着眼于其他CRL复合体,尤其是CRL2复合体,研究其与流感病毒复制之间的关系,探究Cullin-2影响流感病毒感染宿主的分子调控机制,旨在为流感致病性机制研究提供新的思路。CRL复合物是作为E3连接酶中最大的家族,负责识别底物蛋白并将其泛素化。病毒作为一种结构简单的细胞寄生型生物,常常会利用宿主的CRL复合物,激活、劫持或干扰其底物的降解,创造有利病毒复制的环境。本研究通过分析A型流感病毒Ca09(H1N1)感染A549细胞6小时后的转录组学数据,发现在流感病毒感染后,cullin2、cullin5和CRL激活抑制分子CAND1基因的转录水平显著下调,这表明多种CRL相关基因可能在流感病毒感染早期发挥重要作用。为了研究CRL复合物对流感病毒复制以及对宿主细胞因子表达的影响,本研究根据8种Cullin蛋白以及CRL激活所需的NAE1酶的基因设计sgRNA,构建入Lenti-CRISPRv2慢病毒载体中,转染293T细胞,收获包装完成的慢病毒,感染A549细胞,通过嘌呤霉素筛选,结果分别获得了NAE1、cullin2和cullin3基因敲除细胞,接着利用有限稀释法获得Cullin-2蛋白稳定敲除细胞系,命名为CUL2-KO。经蛋白免疫印迹、PCR和测序等方法鉴定,该细胞系构建成功。在获得CUL2-KO敲除细胞系的基础上,本研究进一步探索cullin2基因敲除对流感病毒复制的影响。用流感病毒WSN(H1N1)感染CUL2-KO细胞系和对照组细胞,在不同的时间点(6h、12h、24h、36h)收取细胞样品及细胞上清。通过病毒滴定、Western blot检测,发现cullin2基因敲除对流感病毒复制没有显著影响。然而,利用qRT-PCR检测发现cullin2基因敲除能够增强IAV感染引起的IFN-γ、IL-6等细胞因子的转录上调。进一步研究发现Cullin-2蛋白与NF-κB途径的激活抑制剂IκBα蛋白存在互作,Cullin-2蛋白可能通过调节IκBα的降解从而影响细胞因子的表达,其具体分子调控机制尚有待进一步研究。为了探索cullin2基因敲除增强IAV感染引起的细胞因子转录上调的可能机制,本研究对CUL2-KO细胞进行了蛋白质组学分析,分析cullin2基因敲除后对其他蛋白的表达的影响,发现很多与细胞因子表达相关的蛋白表达量发生了变化,如IFN-γ的受体IFNGR1、白介素-1受体相关激酶IRAK2等蛋白表达上调,为阐明CRL2与流感致病性的关系提供了更多思路。