近年来,随着沿河(海)地带的工业化和城市化进程的加快,工业和生活污水的大量排放,导致养殖水体环境不断恶化,低氧水体面积不断增加。鱼类作为水体中的主要动物群体,水体低氧对鱼类的生长和代谢及胚胎发育有明显的影响。半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是近海名贵的大中型经济鱼类,常栖息于泥沙质海底,并常常钻到泥沙里,提示半滑舌鳎有着独特的低氧适应机制。开展半滑舌鳎低氧反应分子相关基因的克隆并探讨这些基因在低氧胁迫下的反应规律,可为进一步揭示鱼类低氧适应机制提供理论基础。　　本研究首先运用3′和5′RACE方法在半滑舌鳎肝脏中克隆到低氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor,HIF)-1α、Transferrin(Tf)和haemoglobin(Hb)-α1三个基因,分别命名为CsHIF-1α、CsTf和CsHb-α1,这些基因cDNA全长分别为分别为3460 bp、2281bp和594bp;开放阅读框(ORF)长度分别为2208bp、2034bp和432bp,分别编码735、677和143个氨基酸,预测分子量大小分别为82.2kDa、74.9kDa和16.3kDa,理论等电点分别为5.04、6.15和8.59;其5′非翻译区长度分别为243bp、28bp和41bp,3′非翻译区长度分别为1009bp、219bp和121bp。在CsHIF-1α3′非翻译区发现5个mRNA不稳定信号(attta)。在CsTf3′非翻译区发现存在一个多聚腺苷酸加尾信号(aataaa)和一个mRNA不稳定信号(attta)。CsHb-α1的3′非翻译区发现存在一个多聚腺苷酸加尾信号(aataaa)。　　分别对这三个基因编码的氨基酸序列进行结构、潜在功能位点、同源性和系统进化分析。结果显示,CsHIF-1α与其他脊椎动物的同源性在52.3-81.8％之间,与鼠(Mus musculus)HIF-1α(MmHIF-1α)相似性最低,为52.3%,与鲈鱼(Perca fluviatilis)HIF-1α(PfHIF-1α)相似性最高,为81.8%。CsHIF-1α含有保守的bHLH、PAS-A、PAS-B、PAC、ODD、N-TAD和C-TAD结构域。此外,在其他物种中存在的一些重要的氨基酸位点也在 CsHIF-1α中存在。CsTf与其他物种的同源性在25.2-63.3%之间,与牙鲆(Paralichthys olivaceus)的TF(PoTF)最高(63.3%),与果蝇(Drosophila melanogaster)的Tf(DmTf)最低(39.1%)。CsHb-α1与其他脊椎动物的Hb-α1序列相似性在46.2%-58%之间,其中与人Hb-α1相似性最低,为46.2%;与日本青鳉(Oryzias latipes)的Hb-α1相似性最高,为58%。系统进化分析显示CsHIF-1α、CsTf和CsHb-α1均与鱼类中相应的同源分子聚为一支;而鸟类、两栖类和哺乳动物的也分别与相应的同源分子聚类。上述结果证实了CsHIF-1α、CsTf和CsHb-α1为哺乳类HIF-1α、Tf和Hb-α1的同源物。　　为了探讨上述三个基因在低氧胁迫下的反应规律,首先建立了半滑舌鳎β-actin(内参)、CsHIF-1α、CsTf和 CsHb-α1基因相对定量方法,通过融解曲线、峰图分析,显示所建立的方法符合相对定量的要求。随后,以SYBR green I为荧光信号,检测了正常半滑舌鳎各组织HIF-1α、Tf和Hb-α1基因mRNA表达水平,研究结果显示在所检测的正常组织都能检测到这些基因的表达,表明它们在所检测组织中呈组成型表达.。CsHIF-1α和CsTf主要在肝脏中表达,CsHb-α1主要在心、肝、脾脏、肾和血液中表达。在低氧胁迫后,CsHIF-1α、CsTf和CsHb-α1均在不同的组织中上调表达,其中CsHIF-1α在所选取的组织中的表达具有明显的时间依赖关系(P<0.05),CsTf在低氧胁迫的初期也明显上调,但当低氧胁迫90min和120min时,血、腮和胃中的CsTf回复到正常水平(P>0.05)。CsHb-α1则在心、肝、脾、肾、血、腮中的出现了明显的上调(P<0.05)。结果提示上述三个基因在鱼类低氧胁迫中,尤其是在低氧胁迫的初期具有重要的作用。　　最后,应用原核表达系统pET30a构建pET30a-CsHIF1α表达载体,转化宿主菌BL21,在IPTG诱导下表达并纯化了CsHIF-1α融合蛋白,通过将CsHIF1α融合蛋白免疫日本大耳白兔,制备了兔抗CsHIF-1α多克隆抗体,通过Western blotting检测了抗体的特异性,为进一步研究CsHIF-1α的生物学功能奠定了基础。