iNKT细胞是一类固有免疫样T淋巴细胞，主要识别CD1d分子提呈的脂类抗原，活化后可快速分泌多种细胞因子，在免疫应答调控中起到重要作用。iNKT细胞在抗肿瘤免疫中存在两面性，不但具有抗肿瘤的效应，亦可分化为调节性细胞抑制抗肿瘤免疫。实体瘤细胞多为非专职抗原提呈细胞，缺乏共刺激信号，其CD1d分子的高表达对iNKT细胞效应的影响并不明确。因此本研究通过制备高表达CD1d分子的黑色素瘤细胞系，建立小鼠荷瘤模型，研究实体瘤细胞高表达CD1d分子时对iNKT细胞抗瘤效应的影响，为更深一步探讨NKT在肿瘤免疫中的应用与干预策略奠定基础。文章分为以下几个部分:　　一、高表达CD1d的黑色素瘤细胞系的建立　　选用本实验室前期保存的pcDNA3.1(+)空载质粒作为载体，将扩增所得的CD1d编码基因插入该载体的启动子下游，获得pcDNA3.1(+)-[mCD1d]表达质粒。经过特异性引物对该基因片段的PCR鉴定，限制性内切酶的酶切鉴定和DNA测序均证实CD1d基因的序列完全正确，证实构建的质粒已正确插入了目的基因。将构建正确的pcDNA3.1(+)-[mCD1d]重组质粒利用非脂质阳离子聚合物介导法转染至小鼠黑色素瘤细胞B16内，经G418加压筛选出稳定转染的阳性克隆。随后按照有限稀释法进行单克隆化，获得阳性单克隆细胞株。利用流式细胞术检测验证鼠CD1d基因在稳定转染的B16细胞株中的表达。流式细胞术显示B16细胞株能够稳定、高效表达CD1d基因,表明高表达CD1d的B16转染细胞株B16-tmCD1d建立成功。　　二、B16荷瘤模型的建立及iNKT细胞抗瘤效应研究　　取对数生长期的B16细胞和B16-tmCD1d细胞分别接种于C57BL/6J小鼠皮下，按照接种肿瘤细胞数量不同将小鼠分为高数量肿瘤细胞接种组（4×106cells/小鼠），中数量肿瘤细胞接种组（2×106cells/小鼠），低剂量肿瘤细胞接种组（4×105cells/小鼠）。各组成瘤率为100%，说明荷瘤模型建立成功。观察并记录小鼠肿瘤体积的动态变化、成瘤时间以及生存率，发现低剂量肿瘤细胞接种组中，B16-tmCD1d细胞荷瘤小鼠成瘤时间、存活率、肿瘤体积以及肿瘤重量均低于B16细胞荷瘤小鼠，说明肿瘤细胞CD1d高表达可促进机体的抗瘤效应增强。从荷瘤鼠肝、脾、肿瘤这三种组织中分离淋巴细胞并检测，发现iNKT细胞在B16-tmCD1d细胞荷瘤小鼠肿瘤组织中增多，并伴有淋巴细胞与传统T细胞在肿瘤组织中的浸润增多。高数量肿瘤细胞接种组与中数量肿瘤接种组中，CD1d高表达对肿瘤生长抑制作用较弱，但效应趋势与低剂量肿瘤细胞接种组相似。　　另外，B16-tmCD1d细胞接种的Vα14转基因小鼠的肿瘤生长比C57BL/6J小鼠快速，且最后生成的肿瘤也大。这说明iNKT细胞的富集并没有表现出增强的抗瘤效应，提示iNKT主要还是通过间接的调控作用来发挥抗肿瘤作用。　　本研究的意义：　　发现肿瘤细胞CD1d高表达可促进iNKT细胞在肿瘤局域的富集、并通过募集其他淋巴细胞发挥间接抗瘤效应。本研究所建立的CD1d高表达肿瘤细胞荷瘤模型以及对NKT细胞抗瘤效应的探索，为后续研究基于iNKT细胞抗瘤效应的干预策略奠定基础。