他汀类药作为胆固醇合成限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl-glytarylcoenzymeA,HMG-CoA)还原酶的抑制剂已广泛用于心血管疾病的治疗。流行病学资料表明他汀类药物服用者的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)患病率有所降低。有研究报道,辛伐他汀(Simvastatin,SV)能改善阿尔茨海默动物模型小鼠和老龄大鼠的认知功能,但是有关其分子机制迄今仍然不清楚。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)受体是离子型谷氨酸受体的一个亚型。NMDA受体受电压门控和递质门控的双重门控通道影响。烟碱样乙酰胆碱受体 α7亚型(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nACh受体)属于配体门控型离子通道受体。海马的突触可塑性长时程增强(long-term potentiation,LTP)被认为是空间学习和记忆的一种细胞模式。LTP的诱导依赖于突触后神经元的NMDA受体Ca2+内流。α7nACh受体作为Ca2+通道型受体,或通过诱导 PI3K-Akt(phosphatidylinosito 1-3 kinase-protein kinase B)和 ERK(extracellular-signal regulated kinase)信号通路,对于海马突触前神经递质释放和LTP诱导起到重要的调控作用。抑制HMG-CoA还原酶能降低类异戊二烯化合物水平,如焦磷酸法呢酯(farnesyl-pyrophosphate,FPP)和焦磷酸香叶酯(geranylgeranyl-pyrophosphate,GGPP)。类异戊二烯化合物通过法尼基化小G蛋白调节Ras、Rho和Rab的活性。有研究报道敲除Ras基因能促进Src和NMDA受体亚基NR2B的磷酸化,增强NMDA受体活性。本课题提出SV可能通过降低类异戊二烯化合物来调控修饰NMDA受体和α7nACh受体的表达和活性,促进海马突触可塑性LTP的诱导,从而提高空间认知功能的科研设想。因此,我们首先研究SV对海马突触传递功能和可塑性的影响,再进一步研究SV对NMDA受体和α7nACh受体的修饰作用及其调控机制,以阐明SV促进海马LTP诱导和增强空间认知功能的分子机制。研究目的1.明确SV对小鼠认知传递功能和海马突触可塑性的影响;2.阐明SV对NMDA受体的修饰作用及其分子机制;3.阐明SV对α7nACh受体的调控作用及其分子机制。材料与方法1.模型制备:(1)成年ICR雄鼠连续30天给予辛伐他汀20mg/kg/d灌胃(以下简称30d-SV小鼠)(第一部分实验)；出生后25-30天的ICR乳鼠连续5天给予辛伐他汀20mg/kg/d腹腔注射(简称5d-SV小鼠)(第二部分实验);(2)出生后25-30天的ICR乳鼠用SV(10μM)海马脑片孵育4h(简称SV脑片)(第二和第三部分实验);(3)法尼基转化酶抑制剂FTI(50 mg/kg)腹腔注射(简称FTI小鼠);(4)法尼基转化酶抑制剂FTI(1μmol/l)处理(简称FTI脑片)2.用Morris水迷宫的暗台试验和轨迹试验,Y迷宫检查小鼠的认知功能。3.用场电位方法检测海马Schaffer侧支-CAl(ComuAmmonisl field)突触传递(输入-输出曲线,I/O曲线,input-output relationship曲线),神经递质释放(双脉冲易化,paired-pulse facilitation,PPF),长时程增强(LTP)。4.用全细胞膜片钳记录检测NMDA受体、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxa-zolep-propionate 受体,AMPA 受体)和α7nACh受体电流。5.用Wester blot检测海马GluN2A、GluN2B蛋白水平,GluN2A、GluN2B、Src、PKC(protein kinas C)、PKA(protein kinas A)、CaMK II(calmodulin-kinase II)、Akt、Erk磷酸化水平。6.用 RT-PCR 检测 GluN2A、GluN2B 表达。7.膜蛋白检测实验:用生物素化,提取膜蛋白,检测α7nACh受体在膜表面的表达水平。8.免疫沉淀(IP):检测α7nACh受体在苏氨酸位点和丝氨酸位点的磷酸化水平。9.染色质免疫沉淀分析(Chromatin Immunoprecipitation,Chip):采用 Chip分析GluN2B基因启动子区的乙酰化水平。结果结果一 SV通过减少焦磷酸法呢酯能促进海马突触传递和LTP,增强空间认知1.连续30天SV处理(30d-SV)引起成年小鼠在水迷宫暗台实验中的登台潜伏期明显减少,在轨迹实验中站台象限的游泳时间延长,以及在Y迷宫实验中的进臂交替率增加,提示SV能增强小鼠的空间认知功能。2.30d-SV 小鼠海马 Schaffer 侧支-CA1 的 EPSP(excitatory post-synaptic potentiation)斜率比与对照小鼠增加,伴有PPF比率降低,提示SV能促进谷氨酸的释放。3.与对照小鼠相比,30d-SV小鼠海马NMDA受体依赖性LTP幅值增加——SV能增强LTP,NMDA受体非依赖性LTP诱导阈值降低——SV能易化LTP诱导。4.在30d-SV小鼠海马的Akt及ERK2磷酸化水平增强。MLA能抑制30d-SV小鼠Akt和ERK2磷酸化水平增强。5.α7nACh受体阻断剂MLA,MEK抑制剂U0126和PI3K抑制剂LY294002能阻止30d-SV小鼠LTP诱导易化;MLA、U0126可阻止30d-SV小鼠LTP诱导增强,而此作用不受LY294002影响。6.用法尼醇(FOH)处理30d-SV小鼠,通过补充焦磷酸法呢酯(FPP)水平,能阻止SV增强空间认知和促进递质释放和LTP诱导。结果二SV通过降低FPP促进NMDA受体的表达和活性1.连续5天SV处理(5d-SV)小鼠或者海马脑片进行SV孵育(SV脑片)都能增大NMDA受体电流(INMDA)的幅值,但是AMPA受体电流(IAMPA)幅值没有明显改变。用FOH可以阻断SV对INMDA幅值的增强作用。用FTI连续5天处理小鼠(FTI小鼠)也显示INMDA幅值增强。2.海马GluN2A和GluN2B的磷酸化水平在5d-SV小鼠,SV脑片或FTI小鼠都明显高于对照组水平。FOH可以阻断SV对GluN2A/2B磷酸化的增强作用。3.与对照组相比,5d-SV 小鼠或者 FTI(Farnesyl Transferase Inhibitor)小鼠显示GluN2B蛋白表达水平增强,但是SV脑片GluN2B蛋白表达不改变。FOH可以阻断SV增强GluN2B蛋白表达。4.SV和FTI能增加Src的磷酸化。Src抑制剂PP2能阻断SV和FTI对INMDA幅值及GluN2A/2B磷酸化的增强作用,但是不影响GluN2B表达的增加。5.5d-SV小鼠或者FTI小鼠显示GluN2B的H3K9和H3K27组蛋白乙酰化水平增加。FOH可以抑制5d-SV小鼠的GluN2B组蛋白乙酰化水平增加。结果三SV通过降低FPP增强α7nACh受体活性和促进α7nACh受体上膜1.在SV脑片的海马CA1锥体细胞,乙酰胆碱(ACh)诱导电流(IACh)的幅值明显增加,但是配体的亲和力及受体脱敏半衰期没有明显改变,提示SV增加α7nACh受体活性。2.与对照组相比,在SV脑片α7nACh受体膜蛋白水平明显增加,而α7nACh受体磷酸化水平没有改变,提示SV能促进α7nACh受体上膜。3.FOH可以阻断SV增加IACh幅值和α7nACh受体上膜。FTI脑片显示IACh幅值和α7nACh受体膜蛋白水平增加。4.与对照组相比,SV脑片的PKC和CaMKII磷酸化水平增加。FOH可以阻断SV脑片的CaMKII磷酸化水平增加,但是不影响PKC磷酸化增加。FTI脑片出现CaMKII磷酸化水平增强,而不改变PKC磷酸化水平。IP3受体抑制剂2-APB能阻止SV脑片PKC磷酸化水平增加。5.CaMKII抑制剂KN93能阻断SV脑片的IACh幅值和α7nACh受体膜蛋白水平增加。PKC抑制剂GF109203X和Go6983仅仅能阻断SV脑片的IACh幅值增加。总结SV通过降低FPP水平促进GluN2B乙酰化导致NMDA受体表达增加,和促进Src介导GluN2B/2A磷酸化,导致NMDA受体活性增加。SV通过降低FPP水平促进NMDA受体介导的CaMKⅡ磷酸化,增加α7nACh受体上膜;SV增加IP3受体介导的PKC磷酸化,增强α7nACh受体活性。SV通过增强海马Schaffer侧支-CA1的α7nACh受体介导的突触传递功能和NMDA受体依赖性LTP诱导,导致小鼠空间认知功能增强。