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研究背景:
医用臭氧疗法由于其使用方便、效果佳，已经广泛应用于腰椎间盘突出症和骨关节炎的治疗。然而有一些研究表明在应用医用臭氧治疗腰椎间盘突出症时，医用臭氧过量、不规范使用会引起体内氧化和抗氧化系统失衡，造成神经系统的损伤。由于神经系统对氧化/抗氧化失衡极其敏感，所以在应用过量医用臭氧治疗腰椎间盘突出症时，有造成脊髓神经损伤的风险。虽然医用臭氧引起神经损伤的机制尚不清楚，但是与其强氧化性有着不可分割的联系。Li等的研究表明医用臭氧可激活内质网应激调节CaMKⅡ/MAPK通路活性和促进钙离子的释放，从而造成神经损伤。自噬和Nuclearfactorerythroid-2-relatedfactor2(NRF2)-antioxidantresponseelement(ARE)通路都是体内重要的抗氧化通路。正常境况下Kelch-likeECH-associatedprotein1(KEAP1)与NRF2结合抑制其入核从而降低体内抗氧化水平。P62是自噬下游通路的关键因子，它能竞争性抑制KEAP1与NRF2结合，使NRF2游离而变得稳定，促进NRF2入核，提高体内的抗氧化水平。另一方面NRF2可以激活P62的表达，两者形成一个正反馈环路，共同维持体内的氧化/抗氧化系统平衡。另外自噬和NRF2-ARE通路对神经系统的形成、损伤修复、退化都有着非常重要的影响。应用NRF2的激活剂Tert-butylhydroquinone(tBHQ)激活NRF2通路探讨其在神经系统的保护、抗炎和抗氧化中的作用以及其对自噬活性的影响，已经得到研究者们的广泛关注。但目前尚缺乏tBHQ激活NRF2通路在过量臭氧造成的神经损伤中所起作用的研究。本实验目的是应用tBHQ活化NRF2，进一步探索P62-NRF2-ARE通路在过量医用臭氧造成的神经损伤中所起的作用。
研究方法:
①从新生24h内Wistar大鼠体内提取脊髓神经元，原代培养7天后用于后续实验;②应用MAP2标记所培养细胞，细胞免疫荧光鉴定神经元纯度;③分别用0、10、20、30、40μg/ml医用臭氧处理细胞，用CCK8法检测细胞活力选择合适的医用臭氧浓度作为后续实验浓度;④随后实验分为5组:对照组(Control组);30μg/ml医用臭氧组(O3-30组);40μg/ml医用臭氧组(O3-40组);40μg/ml医用臭氧+tBHQ组(T40组);tBHQ组(T0组)。用RT-qPCR和WesternBlot分别在mRNA水平和蛋白水平检测NRF2，HO1，P62，LC3表达的改变。⑤NRF2荧光染色，细胞免疫荧光检测不同组间核内NRF2表达的改变;⑥Normal/Apoptotic/NecroticCellDetectionKit(AO/EB)检测各组之间存活/凋亡/坏死细胞的比率。
研究结果:
1.培养的原代脊髓神经元采用MAP2鉴定，纯度在95％以上符合实验要求;
2.CCK8结果显示40μg/ml医用臭氧作用于细胞，细胞活性突降至71％，选择40μg/ml浓度医用臭氧作为后续实验浓度;
3.RT-qPCR显示:和Control组相比，O3-40μg/ml医用臭氧组P62和LC3Ⅱ的mRNA水平改变无统计学意义(P＞0.05)。T0组NRF2和HO1的mRNA水平升高较Control组有统计学意义(P＜0.05)，这说明tBHQ激活了NRF2信号通路。O3-40组HO1水平较O3-30组明显降低(P＜0.05)，T40组NRF2水平较O3-40组明显增高(P＜0.05)，HO1水平未见下降。
4.WesternBlot显示:O3-30组NRF2和HO1蛋白水平较Control组明显增加，O3-40组HO1蛋白水平较O3-30组降低，T40组反转了O3-40组蛋白水平的降低。O3-30组P62和LC3Ⅱ的蛋白表达较Control组明显增加，O3-40组两者水平较O3-30组明显下降，T40组较O3-40组P62和LC3Ⅱ的蛋白表达明显增加。
5.细胞免疫荧光显示:O3-40组核内NRF2水平较O3-30组明显下降。T40组核内NRF2水平较O3-40组明显增加;
6.AO/EB显示:O3-40组活细胞减少，坏死率增高，而在T40组坏死率较O3-40组下降，活细胞较O3-40组增加。
实验结论:
40μg/ml医用臭氧可以通过损害P62/NRF2/ARE信号通路干扰NRF2入核对体外培养的原代神经元造成损伤;tBHQ可通过激活自噬和NRF2通路，在40μg/ml医用臭氧造成的体外培养的原代神经元损伤中起到保护作用。
医用臭氧疗法由于其使用方便、效果佳，已经广泛应用于腰椎间盘突出症和骨关节炎的治疗。然而有一些研究表明在应用医用臭氧治疗腰椎间盘突出症时，医用臭氧过量、不规范使用会引起体内氧化和抗氧化系统失衡，造成神经系统的损伤。由于神经系统对氧化/抗氧化失衡极其敏感，所以在应用过量医用臭氧治疗腰椎间盘突出症时，有造成脊髓神经损伤的风险。虽然医用臭氧引起神经损伤的机制尚不清楚，但是与其强氧化性有着不可分割的联系。Li等的研究表明医用臭氧可激活内质网应激调节CaMKⅡ/MAPK通路活性和促进钙离子的释放，从而造成神经损伤。自噬和Nuclearfactorerythroid-2-relatedfactor2(NRF2)-antioxidantresponseelement(ARE)通路都是体内重要的抗氧化通路。正常境况下Kelch-likeECH-associatedprotein1(KEAP1)与NRF2结合抑制其入核从而降低体内抗氧化水平。P62是自噬下游通路的关键因子，它能竞争性抑制KEAP1与NRF2结合，使NRF2游离而变得稳定，促进NRF2入核，提高体内的抗氧化水平。另一方面NRF2可以激活P62的表达，两者形成一个正反馈环路，共同维持体内的氧化/抗氧化系统平衡。另外自噬和NRF2-ARE通路对神经系统的形成、损伤修复、退化都有着非常重要的影响。应用NRF2的激活剂Tert-butylhydroquinone(tBHQ)激活NRF2通路探讨其在神经系统的保护、抗炎和抗氧化中的作用以及其对自噬活性的影响，已经得到研究者们的广泛关注。但目前尚缺乏tBHQ激活NRF2通路在过量臭氧造成的神经损伤中所起作用的研究。本实验目的是应用tBHQ活化NRF2，进一步探索P62-NRF2-ARE通路在过量医用臭氧造成的神经损伤中所起的作用。
研究方法:
①从新生24h内Wistar大鼠体内提取脊髓神经元，原代培养7天后用于后续实验;②应用MAP2标记所培养细胞，细胞免疫荧光鉴定神经元纯度;③分别用0、10、20、30、40μg/ml医用臭氧处理细胞，用CCK8法检测细胞活力选择合适的医用臭氧浓度作为后续实验浓度;④随后实验分为5组:对照组(Control组);30μg/ml医用臭氧组(O3-30组);40μg/ml医用臭氧组(O3-40组);40μg/ml医用臭氧+tBHQ组(T40组);tBHQ组(T0组)。用RT-qPCR和WesternBlot分别在mRNA水平和蛋白水平检测NRF2，HO1，P62，LC3表达的改变。⑤NRF2荧光染色，细胞免疫荧光检测不同组间核内NRF2表达的改变;⑥Normal/Apoptotic/NecroticCellDetectionKit(AO/EB)检测各组之间存活/凋亡/坏死细胞的比率。
研究结果:
1.培养的原代脊髓神经元采用MAP2鉴定，纯度在95％以上符合实验要求;
2.CCK8结果显示40μg/ml医用臭氧作用于细胞，细胞活性突降至71％，选择40μg/ml浓度医用臭氧作为后续实验浓度;
3.RT-qPCR显示:和Control组相比，O3-40μg/ml医用臭氧组P62和LC3Ⅱ的mRNA水平改变无统计学意义(P＞0.05)。T0组NRF2和HO1的mRNA水平升高较Control组有统计学意义(P＜0.05)，这说明tBHQ激活了NRF2信号通路。O3-40组HO1水平较O3-30组明显降低(P＜0.05)，T40组NRF2水平较O3-40组明显增高(P＜0.05)，HO1水平未见下降。
4.WesternBlot显示:O3-30组NRF2和HO1蛋白水平较Control组明显增加，O3-40组HO1蛋白水平较O3-30组降低，T40组反转了O3-40组蛋白水平的降低。O3-30组P62和LC3Ⅱ的蛋白表达较Control组明显增加，O3-40组两者水平较O3-30组明显下降，T40组较O3-40组P62和LC3Ⅱ的蛋白表达明显增加。
5.细胞免疫荧光显示:O3-40组核内NRF2水平较O3-30组明显下降。T40组核内NRF2水平较O3-40组明显增加;
6.AO/EB显示:O3-40组活细胞减少，坏死率增高，而在T40组坏死率较O3-40组下降，活细胞较O3-40组增加。
实验结论:
40μg/ml医用臭氧可以通过损害P62/NRF2/ARE信号通路干扰NRF2入核对体外培养的原代神经元造成损伤;tBHQ可通过激活自噬和NRF2通路，在40μg/ml医用臭氧造成的体外培养的原代神经元损伤中起到保护作用。