目的马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephropathy，AAN）是由于服用含有马兜铃酸（chronic aristolochic acid，AA）的中草药导致的肾损害疾病，病理改变主要为肾小管萎缩消失、肾小管基底膜增厚屈曲；肾间质片状或弥漫性纤维化；小动脉壁增厚、管腔狭窄；肾小球缺血性皱缩、硬化。多数为慢性AAN（chronic aristolochic acid nephropathy，CAAN），呈现典型的慢性肾小管间质肾病，而慢性肾脏疾病的进展是一个不可逆转的过程，最终导致终末期肾衰竭。目前CAAN的发病机制尚未十分清楚，所以缺乏统一可靠的治疗方法，深入探讨AAN的发生机制，寻找新的有效预防和治疗措施，控制和延缓肾衰竭进展，是目前研究的重点之一。近年来干细胞移植已成为医学领域的研究热点。研究证明，骨髓干细胞除向血液系统定系分化外，还可以跨系分化为其他系统有功能的组织成分，包括向肾组织细胞分化，这为难治性肾脏疾病（如CAAN）的治疗提供了新思路。本研究通过建立CAAN动物模型，并予以骨髓干细胞移植，旨在探讨干细胞向CAAN肾脏细胞分化的潜能及对CAAN的治疗作用，并进而推断CAAN的发病机制。本试验从以下三个方面进行了研究：①骨髓源性干细胞向慢性马兜铃酸肾病大鼠肾小管上皮细胞分化潜能的研究；②干细胞移植对慢性马兜铃酸肾病大鼠的治疗作用；③干细胞移植对慢性马兜铃酸肾病大鼠肾组织α-SMA、CK18、TGF-β1、HGF表达的影响。材料与方法第一部分：雌性Wistar大鼠37只，随机分为2组：①移植组（n=16只），予以关木通煎剂灌胃(20g．kg^-1．d^-1，相当于10ml．kg^-1．d^-1)，分两次给予，每周连续用药5天，共12周。然后予以亚致死剂量X线照射后经尾静脉注射途径移植同系雄性Wistar大鼠骨髓干细胞（骨髓干细胞1×10⁸个／只，0.35ml／只）。于尾静脉注射干细胞后第30天、第60天分别处死8只大鼠。②非移植组（n=21只），予以关木通煎剂灌胃(20g．kg^-1．d^-1，相当于10m1．kg^-1．d^-1)，分两次给予，每周连续用药5天，共12周。然后予以尾静脉注射等量生理盐水（0.35ml／只），于尾静脉注射生理盐水后第30天、第60天分别处死8只大鼠。其中随机选取5只大鼠于注射生理盐水前与移植组一起接受X线照射，并于第30天时处死5只大鼠。另设正常对照组（n=5只）：均为雄性Wistar大鼠，自由进食水，实验结束时全部处死。大鼠在处死时留取肾组织标本。本部分用连续切片做免疫荧光（IF）染色结合Y染色体荧光原位杂交（Y-FISH）方法，主要观察移植组大鼠肾组织中骨髓源性干细胞的分化情况。非移植组（第30天时），肾组织切片做HE染色观察X线照射对肾组织病理改变的影响。第二部分：雌性Wistar大鼠40只，随机分为3组：①移植组（n=16只），予以关木通煎剂灌胃(20g．kg^-1．d^-1，相当于10ml．kg^-1．d^-1)，分两次给予，每周连续用药5天，共12周。然后予以亚致死剂量X线照射后经尾静脉注射途径移植同系雄性Wistar大鼠骨髓干细胞（骨髓干细胞1×10⁸个／只，0.35ml／只）。于尾静脉注射干细胞后第30天、第60天分别处死8只大鼠。②非移植组（n=16只），予以关木通煎剂灌胃(20g．kg^-1．d^-1，相当于10ml．kg^-1．d^-1)，分两次给予，每周连续用药5天，共12周。然后予以尾静脉注射等量生理盐水（0.35ml／只）。于尾静脉注射生理盐水后第30天、第60天分别处死8只大鼠。③正常对照组（n=8只），予以饮用水10ml．kg^-1．d^-1（分两次给予）灌胃，每周连续5天，共12周，然后经尾静脉注射等量生理盐水（0.35ml／只）。并于尾静脉注射生理盐水后第60天处死8只大鼠。大鼠在处死前留尿测24小时尿蛋白定量、处死时留取血、尿标本。做血尿素氮、肌酐、血红蛋白、尿β₂-MG、尿NAG检测。观察各组大鼠临床相关指标的动态变化。第三部分：雌性Wistar大鼠40只，随机分为3组：①移植组（n=16只），予以关木通煎剂灌胃(20g．kg^-1．d^-1，相当于10ml．kg^-1．d^-1)，分两次给予，每周连续用药5天，共12周。然后予以亚致死剂量X线照射后经尾静脉注射途径移植同系雄性Wistar大鼠骨髓干细胞（骨髓干细胞1×10⁸个／只，0.35ml／只）。于尾静脉注射干细胞后第30天、第60天分别处死8只大鼠。②非移植组（n=16只），予以关木通煎剂灌胃(20g．kg^-1．d^-1，相当于10ml．kg^-1．d^-1)，分两次给予，每周连续用药5天，共12周。然后予以尾静脉注射等量生理盐水（0.35ml／只）。于尾静脉注射生理盐水后第30天、第60天分别处死8只大鼠。③正常对照组（n=8只），予以饮用水10ml．kg^-1．d^-1（分两次给予）灌胃，每周连续5天，共12周，然后经尾静脉注射等量生理盐水（0.35ml／只）。并于尾静脉注射生理盐水后第60天处死8只大鼠。大鼠在处死时留取肾组织标本。做HE及Masson染色，光镜观察干细胞移植前后CAAN大鼠肾脏组织形态学变化情况；电镜观察肾小管上皮细胞的超微结构变化；应用免疫组化方法检测移植前后肾脏α-SMA、CKl8、TGF-β₁和HGF表达的变化；RT-PCR方法检测移植前后α-SMA、CK18、TGF-B₁和HGF的mRNA表达变化；Western blot技术检测移植前后α-SMA、CK18、TGF-β₁和HGF的蛋白表达变化。数据处理：采用SPSS12.0统计软件分析处理，计量数据x±s表示，组间差异采用单因素方差分析，P＜0.05为有显著性差异。结果第一部分：①正常对照组：雄性大鼠肾组织切片经Y-FISH检测观察到Y染色体阳性（Y⁺，黄绿色荧光亮点）杂交细胞。②非移植组：雌性CAAN大鼠，生理盐水注射后第30天及第60天肾组织切片经Y-FISH检测均未观察到Y⁺杂交细胞。③移植组：在骨髓干细胞移植后第30天、第60天时，大鼠肾组织切片经Y-FISH检测亦观察到Y⁺杂交细胞，同时连续切片做免疫荧光染色检测观察到其表达肾小管上皮细胞的表型特征CK18和RCAⅠ（CK18⁺、RCAⅠ⁺）。④非移植组（第30天时）经X线照射和未照射大鼠肾组织切片做HE染色：结果未发现两组大鼠形态结构存在明显差异，说明该剂量X线照射对CAAN肾脏无特殊影响。第二部分：①肾功能测定结果：非移植组BUN、Cr逐渐升高，第30天、第60天时BUN值分别为19.25±4.26、25.04±6.5，与正常对照组比较有统计学意义P＜0.01；移植组BUN、Cr明显降低，第30天、第60天时BUN值分别为11.47±3.19、9.71±3.74，与非移植组比较有统计学意义P＜0.01但仍高于正常对照组高，差异有统计学意义P＜0.01。②血红蛋白测定结果：非移植组HB进行性下降，与正常对照组比较有统计学意义P＜0.01；移植组明显改善，移植组与非移植组、正常对照组比较差异均有统计学意义P＜0.01。③24小时尿蛋白结果：非移植组第30天、第60天尿蛋白逐渐升高，分别是正常对照组的5.3、7.8倍，与正常对照组比较差异有统计学意义P＜0.01；移植组则明显降低，分别为正常对照组的2.4、1.9倍，与非移植组比较差异有统计学意义P＜0.01，移植组第30天与正常对照组比较差异有统计学意义P＜0.01，第60天与正常对照组比较差异无统计学意义P＞0.05。④尿β₂-MG：与正常组比较，非移植组明显增高P＜0.05；干细胞移植组较非移植组明显减少，存在显著性差异P＜0.05，但仍高于正常组P＜0.05。⑤尿NAG：正常肾脏有一定量分泌。与正常组比较，非移植组第30天明显增多（P＜0.05），第60天有所减少P仍＜0.05，非移植组内比较P＞0.05；干细胞移植组较非移植组明显减少，存在显著性差异P＜0.05，但仍高于正常组P＜0.05。第三部分：①肾脏病理学检查发现非移植组损伤严重、肾间质纤维化明显，肾间质纤维化面积于第30天、第60天分别为0.20±0.016、0.25±0.02，经干细胞移植后损伤减轻、无明显纤维化，纤维化面积分别为0.13±0.006、0.12±0.005，与正常对照组和移植组相比，非移植组大鼠肾间质纤维化面积明显增加P＜0.01；电镜观察移植组肾小管上皮细胞超微结构较对照组明显改善。②免疫组化染色显示：移植组肾脏α-SMA少量表达，非移植组，随着病变时间的延长肾小管-间质细胞α-SMA的表达明显增强，表达量明显高于移植组和正常对照组P＜0.01；移植组肾脏CK18阳性表达较非移植组逐渐增多，非移植组表达较逐渐减少、甚至完全缺乏、特别是在严重萎缩的肾小管和大面积间质纤维化区域，与移植组和对照组相比P＜0.01。移植组肾脏TGF-β1阳性表达比非移植组明显减弱，但仍明显高于正常组P均＜0.01；移植组肾脏HGF阳性表达比非移植组增强，非移植组表达先升高后下降，与移植组、对照组相比P均＜0.01。以上指标肾脏免疫印迹分析显示了同样的变化趋势。③RT-PCR显示，移植组肾脏α-SMA的mRNA表达水平较非移植组下降，P＜0.01；移植组肾脏CK18的mRNA表达水平比非移植组增加，与非移植组相比P＜0.01；移植组肾脏TGF-β1的mRNA表达较非移植组减少，P＜0.01；移植组肾脏HGFmRNA表达比非移植组增多P＜0.01。结论本研究结果表明：（1）移植组（第30天、第60天）和正常对照组（雄性）大鼠肾组织切片经Y-FISH检测均观察到Y染色体阳性杂交细胞，而非移植组雌性CAAN大鼠肾组织切片经Y-FISH检测未观察到Y⁺细胞；同时，移植组大鼠肾组织切片经免疫荧光检测观察到这些旷细胞部分表达肾小管上皮细胞的表型特征CKl8和RCAⅠ（CK18⁺、RCAⅠ⁺）。证明骨髓源性干细胞具有向CAAN大鼠肾脏小管上皮细胞分化的潜能。（2）骨髓干细胞移植可以明显改善CAAN大鼠的肾功能、提高血红蛋白水平、减少24小时尿蛋白和β₂-MG的丢失、降低尿NAG含量。说明骨髓干细胞移植对CAAN有治疗作用。这不仅给CAAN的治疗开拓干细胞治疗的新途径，而且也为其他原因所致的肾衰竭的治疗带来新的希望。（3）骨髓干细胞移植能明显减轻CAAN大鼠肾脏病理损害，减轻肾间质纤维化；降低肾脏α-SMA、TGF-β1蛋白和mRNA表达，提高肾脏CK18、HGF蛋白和mRNA的表达；从而在细胞和细胞因子水平，证明骨髓干细胞移植能减轻肾损害和肾间质纤维化。这将为CAAN甚至其他肾小管间质纤维化疾病的治疗提供有益的参考。（4）干细胞移植对CAAN具有治疗作用的实验结果，使我们推测CAAN很可能存在干细胞损伤或缺乏，这也为CAAN发病机制的研究提供新的研究方向和实验室根据。