梅(Prunus mune Sieb.et Zucc.)原产中国,属蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus L.)植物,在我国的栽培利用已有三千多年的历史,需冷量范围比较大,从26.3 CP到75.7 CP,在研究果树季节性休眠机制中具有独特优势。大量研究发现,GA4对调控植物的休眠起到关键的作用,且发现用GA4喷施果梅枝条可以解除芽的休眠。本研究以果梅为材料,采用紫外分光光度计法和qRT-PCR技术,研究了不同处理解除休眠过程中,果梅芽内H2O2含量、抗氧化酶类活性的变化;以及抗氧化酶类编码基因和信号相关基因的表达变化。对H2O2在外源GA4解除果梅芽休眠中起到的信号作用进行分析。以杨树组培苗为材料,通过农杆菌介导的方法,将构建完成的PmRGL2基因过表达载体转化到杨树组培苗中,测定转基因杨树苗叶片中的H2O2含量和抗氧化酶类活性;并对抗氧化酶类编码基因及信号相关基因进行表达分析;并采用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)技术,测定了转基因组培苗和杨树组培苗中的GA4含量。主要结果如下:1.以高需冷量果梅品种’丰后’为试材,分别于2013年及2014年果梅树体自然休眠期多次采集枝条,研究200 μM GA4处理和10 mM H2O2以及质量分数为1%的H2O2处理对人工气候室内水培枝条萌芽率和H2O2含量、抗氧化酶类活性及H2O2相关基因和信号相关基因表达的影响。结果表明,200 μMGA4处理的枝条花芽的萌芽率明显高于1%H202、10 mM H2O2处理和对照,且南京地区最佳处理时期为元旦前后;在GA4处理促进果梅休眠解除期间,H2O2含量在果梅花芽休眠解除时达到峰值,并且控制细胞内 H2O2 产生的最主要的基因Respiratory burst oxidase homolog protein E(NADP Hoxi-E)以及促进H2O2产生的超氧化物歧化酶(SOD)活性以及其编码基因Superoxide dismutase[Cu-Zn](SOD[Cu-Zn])也在此时达到峰值。过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)具有清除H2O2的作用,二者的活性分别在H2O2含量到达峰值之前和到达峰值之时受到抑制,但是二者的编码基因Probablephospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase 和 Catlase l-like 的表达量一直维持在较高水平。其他相关基因在200 μM GA4处理花芽中的表达也都明显与其他处理及对照不同,且具有规律性,这些基因包括:DELLA蛋白基因GAI及赤霉素受体蛋白基因GID1B-like,Ca/calmodulin-dependent protein kinases related kinase 5(CDPK-5),Mitogen-activated protein kinase 9(MAPK-9)以及Calreticulin-3-like(CRT-3-like)。基于对 H2O2可能在休眠解除期间作为信号物质的认识,推测GA4打破果梅花芽休眠可能通过相关基因控制抗氧化酶类活性,调控H2O2含量的变化,并引起H2O2上下游多种信号相关基因表达水平的变化,最终对休眠解除起作用。2.以二年生高需冷量果梅品种’丰后’嫁接苗及低需冷量品种’桃形梅’嫁接苗为试材,采用0～7.2℃模型记录低温积累时数,于果梅需冷量进程不同时期对树体进行GA4处理,研究GA4处理人工气候室内果梅嫁接苗叶芽萌芽率和H2O2及抗氧化相关酶类活性的影响。结果显示,GA4处理的果梅叶芽萌芽率明显高于对照;250μMGA4解除’桃形梅,叶芽休眠的最佳处理时期为低温累计达到其需冷量的三分之一左右;300μM GA4解除’丰后’叶芽休眠的最佳处理时期为低温累计达到其需冷量的二分之一左右。研究发现GA4和对照处理后,两个品种叶芽中的抗氧化酶类活性都有不同幅度上升,但是GA4处理后抗氧化酶活性显著高于对照。且低需冷量果梅品种’桃形梅’相比高需冷量的果梅品种’丰后’,具有更高的CAT活性和POD活性,而两个品种的SOD活性大小并没有显著的差异,推测CAT和POD这两种抗氧化酶在果梅休眠解除过程中起到更重要作用。根据叶芽内H2O2含量和抗氧化酶类活性变化,推测GA4打破果梅叶芽休眠可能与花芽休眠解除类似,都是通过抗氧化酶系统调控H2O2含量的变化来对休眠解除起作用。3.构建了PmRGL 基因过表达载体,并以杨树组培苗为试验材料,通过农杆菌介导的方法,将过表达载体转化到杨树中。本研究使用的pYH4215载体具有对潮霉素的抗性,因此转基因苗可以在含有潮霉素的培养基上存活。为进一步确定抗潮霉素杨树植株确实为转基因植株,除对杨树叶片进行GUS染色外,还提取了转基因杨树叶片的基因组DNA,以pYH4215载体中潮霉素的基因设计特异引物,对转基因苗进行PCR检测。另外,也对转基因杨树外源PmRGL2进行PCR检测,结果初步表明,已经将PmRGL2基因成功转入杨树基因组中。以转化成功的转基因杨树苗叶片为材料,测定GA4含量、H2O2含量和抗氧化酶类活性,并对抗氧化酶类编码基因及赤霉素信号转导相关基因进行表达分析。结果表明,转基因杨树苗中的GA4含量、H2O2含量和NADPH氧化酶的编码基因NADPHoxi的表达量都显著低于对照;抗氧化酶类活性和对应编码基因的表达量则高于对照;与赤霉素合成相关的GA20oxi和GA3oxi的表达量低于对照,而编码赤霉素受体蛋白的GID1基因的表达量显著高于对照;与信号转导相关的 Mitogen-activated protein kinase(MAPK)和 CDPK-related kinase 1 family(CDPK)的表达量显著低于对照、而Calreticulin family protein(CRT)基因在转基因杨树苗中的表达显著高于对照。说明PmRGL2基因能够通过降低杨树叶片NADPHoxi的表达量,抑制H2O2的产生,并通过提高编码ROS清除酶类基因的表达量,提高抗氧化酶类活性,从而有利于使叶片中H2O2含量维持在较低水平;进而对赤霉素合成及信号相关基因的表达量变化以及对叶片中的GA4含量产生影响,最终影响杨树的生长发育。