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【目的】采用腺病毒介导的lnc RNA NANCI干扰及过表达技术研究NANCI-NKX2.1信号通路在新生小鼠支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)发病机制中的作用。【方法】本研究通过NANCI干扰及过表达两种方式探索NANCI-NKX2.1信号通路参与BPD发病机制:Ⅰ.采用腺病毒介导的NANCI干扰技术处理正常新生小鼠。将32只C57BL/6J(B6)新生小鼠随机分为4组:实验组、阴性对照组、生理盐水对照组和空白对照组,每组8只,实验组于生后第2天经鼻腔吸入含Ad-NANCI sh RNA的生理盐水1ul,阴性对照组将含无关序列发卡结构病毒质粒Ad-GFP NC的生理盐水1ul吸入肺内,生理盐水对照组将生理盐水1ul吸入肺内,空白对照组除未予鼻腔吸入以外其他控制因素与上三组相同。出生7天后处死各组小鼠并采集肺组织(所有操作均符合实验动物管理条例,处死时尽量减少痛苦),冰冻空白切片察看小鼠肺组织荧光表达,苏木精-伊红(HE)染色察看小鼠肺组织病理变化,RT-q PCR检测NANCI表达水平,RT-q PCR及Western Blot技术分别检测NKX2.1、SPC、AQP5mRNA和蛋白表达水平。Ⅱ.采用腺病毒介导的NANCI过表达技术干预高氧诱导的BPD新生小鼠。将32只B6新生小鼠随机分为4组:实验组、阴性对照组、生理盐水对照组和空白对照组,每组8只,四组小鼠均置于高氧环境下饲养(Fi O2≥95%),实验组于生后第2天经鼻腔吸入含Ad-NANCI的生理盐水1ul,阴性对照组将含无关序列发卡结构病毒质粒Ad-GFP的生理盐水1ul吸入肺内,生理盐水对照组将生理盐水1ul吸入肺内,空白对照组除未予鼻腔吸入以外其他控制因素与上三组相同。出生7天后处死各组小鼠并采集肺组织(所有操作均符合实验动物管理条例,处死时尽量减少痛苦),冰冻空白切片察看小鼠肺组织荧光表达,苏木精-伊红(HE)染色察看小鼠肺组织病理变化,RT-q PCR检测NANCI表达水平,RT-q PCR及Western Blot技术分别检测NKX2.1、SPC、AQP5 mRNA和蛋白表达水平。【结果】Ⅰ.采用腺病毒介导的NANCI干扰技术处理正常新生小鼠1.肺组织免疫荧光:新生小鼠鼻内吸入腺病毒载体,一周后实验组及阴性对照组肺组织可见绿色荧光表达;生理盐水及空白对照组未见荧光表达。2.肺组织病理:(1)阴性对照组、生理盐水对照组和空白对照组肺泡大小基本均一,形态尚规整,肺泡间隔较薄;而实验组肺组织新隔形成减少,肺泡腔扩大、部分融合,肺泡二次分隔抑制,肺泡数目较少,肺泡大小不等,肺泡结构紊乱,支气管壁增厚。(2)RAC值:四组间差异有显著性(F=7.26,P=0.001);实验组RAC值下降,与其他三组相比均有统计学意义(均P<0.05);与阴性对照组相比,生理盐水及空白对照组RAC值无显著差别(P>0.05,P>0.05)。3.肺组织NANCI表达:四组间NANCI相对表达量差异有显著性(F=37.96,P=0.000);实验组NANCI相对表达量低于各对照组,为阴性对照组的0.26(P<0.05);与阴性对照组相比,生理盐水及空白对照组NANCI相对表达量均无显著差别(P>0.05,P>0.05)。4.NKX2.1mRNA和蛋白表达:四组间NKX2.1 mRNA相对表达量差异有显著性(F=20.38,P=0.000);实验组低于各对照组,为阴性对照组的0.50(P<0.05);与阴性对照组相比,生理盐水及空白对照组NKX2.1mRNA相对表达量无显著差别(P>0.05,P>0.05)。实验组肺组织NKX2.1蛋白表达低于各对照组(均P<0.05)。5.SPC mRNA和蛋白表达:四组间SPC mRNA相对表达量差异有显著性(F=18.28,P=0.000);实验组低于各对照组,为阴性对照组的0.46(P<0.05);与阴性对照组相比,生理盐水及空白对照组SPC mRNA相对表达量无显著差别(P>0.05,P>0.05)。实验组肺组织SPC蛋白表达低于各对照组(均P<0.05)。6.AQP5 mRNA和蛋白表达:四组间AQP5 mRNA相对表达量差异有显著性(F=21.84,P=0.000);实验组低于各对照组,为阴性对照组的0.48(P<0.05);与阴性对照组相比,生理盐水及空白对照组AQP5 mRNA相对表达量无显著差别(P>0.05,P>0.05)。实验组肺组织AQP5蛋白表达低于各对照组(均P<0.05)。Ⅱ.采用腺病毒介导的NANCI过表达技术干预高氧诱导的BPD新生小鼠1.肺组织免疫荧光:新生小鼠鼻内吸入腺病毒载体,一周后实验组及阴性对照组肺组织可见绿色荧光表达;生理盐水及空白对照组未见荧光表达。2.肺组织病理:(1)实验组肺组织肺泡大小基本均一,形态尚规整,间隔变薄,肺泡腔内可见较多冠状突起,为新生肺泡隔延伸,肺泡平均截距减小,肺泡计数增多,纤维化程度减轻;阴性对照组、生理盐水对照组和空白对照组新隔形成减少,肺泡腔扩大、部分融合,肺泡数目较少。(2)RAC值:四组间差异有显著性(F=8.40,P=0.000);实验组RAC值增高,实验组RAC与其他三组相比均有统计学意义(均P<0.05);与阴性对照组相比,生理盐水及空白对照组RAC值无显著差别(P>0.05,P>0.05)。3.肺组织NANCI表达:四组间NANCI相对表达量差异有显著性(F=57.18,P=0.000);实验组NANCI相对表达量高于各对照组,为阴性对照组的2.70(P<0.05);与阴性对照组相比,生理盐水及空白对照组NANCI相对表达量无显著差别(P>0.05,P>0.05)。4.NKX2.1 mRNA和蛋白表达:四组间NKX2.1 mRNA相对表达量差异有显著性(F=28.04,P=0.000);实验组高于各对照组,为阴性对照组的2.36(P<0.05);与阴性对照组相比,生理盐水及空白对照组NKX2.1mRNA相对表达量无显著差别(P>0.05,P>0.05)。实验组肺组织NKX2.1蛋白表达高于各对照组(均P<0.05)。5.SPC mRNA和蛋白表达:四组间SPC mRNA相对表达量差异有显著性(F=9.22,P=0.000);实验组高于各对照组,为阴性对照组的1.78(P<0.05);与阴性对照组相比,生理盐水及空白对照组SPC mRNA相对表达量无显著差别(P>0.05,P>0.05)。实验组肺组织SPC蛋白表达高于各对照组(均P<0.05)。6.AQP5 mRNA和蛋白表达水平:四组间AQP5 mRNA相对表达量差异有显著性(F=12.94,P=0.000);实验组高于各对照组,为阴性对照组的2.00(P<0.05);与阴性对照组相比,生理盐水及空白对照组AQP5 mRNA相对表达量无显著差别(P>0.05,P>0.05)。实验组肺组织AQP5蛋白表达高于各对照组(均P<0.05)。【结论】采用腺病毒介导的NANCI干扰技术成功构建新生小鼠BPD模型,而腺病毒介导的过表达NANCI对高氧诱导新生小鼠BPD肺组织具有明显的保护作用,提示NANCI-NKX2.1信号通路在BPD新生小鼠中可能起重要作用。