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背景与目的人类Y染色体的非重组区(non-recombination regions of Y chromosome,NRY)为单倍型父系遗传,这使得Y染色体STR (Y short tandem repeat,Y-STR)在法医学个人识别、父权鉴定、男女性混合检材检测、无名男尸的身源确定、不同男性个体混合斑或组织混合物的分析,以及群体迁徙、人类进化及父系家族分析中具有独特的优势,已成为目前法医学检验的主要遗传标记。但由于遗传上的特殊性,与常染色体STR相比,Y-STR单倍型分布具有明显的群体特异性,且Y-STR的个人识别能力和非父排除率也远远低于常染色体STR,要提高Y染色体的鉴别能力,必须尽可能多的联合使用Y-STR基因座。目前,国内主要依赖进口Y-STR试剂盒分析法医物证检材,其所包含的Y-STR基因座数量有限,且由于基于国外白种人开发,在一定程度上难以满足我国法医实际工作需要。因此有必要筛选出更多稳定、多态性好、适合我国人群的Y-STR基因座,并构建具有较高鉴定能力的Y-STR复合扩增体系。本研究旨在筛选更多新的Y-STR基因座,提高Y-STR单倍型的鉴别能力;选取10个新Y-STR基因座,对其中适合MiniSTR引物设计的基因座,进行MiniSTR引物设计;通过对10个Y-STR基因座在潮汕地区汉族群体中的遗传多态性调查,分析它们的等位基因序列和单倍型,为等位基因命名提供依据,为法医学应用提供基础数据;根据群体调查结果,选出其中符合条件的基因座,应用银染复合扩增技术,组建Y-STR复合扩增体系,依据DNA分析技术工作组(the working group on DNA analysis methods,TWGDAM)指南进行法医学可行性研究,以建立检测结果可靠、具有较高个人识别能力的检测方法。材料与方法利用BLAT (BLAST-like alignment tool)软件对GDB数据库(genome database)中的Y-STR基因座进行种属特异性分析,依据具有良好种属特异性、重复序列为单拷贝、重复单位为四或五核苷酸的原则,筛选出10个新Y-STR基因座DYS522、YS549、DYS556、DYS565、DYS568、DYS570、DYS588、DYS593、DYS594、DYS598;用primer 3.0软件和BLAT软件,根据Y-MiniSTR引物设计原则,对DYS565、DYS568、DYS593、DYS594和DYS598基因座重新进行MiniSTR引物设计,其它基因座引物则采用GDB的引物序列。应用PCR反应,对实验DNA样本进行单基因座PCR扩增,扩增产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶连续缓冲体系垂直电泳分型,银染法显色检测;用女性样本和常见动物样本,实验检测10个Y-STR基因座的Y染色体特异性和种属特异性;对潮汕地区汉族159名无关男性个体样本进行分型检测,各基因座的等位基因测序后,按国际法医遗传学会(ISFG)推荐的命名原则命名;采用直接计数法计算10个Y-STR基因座的等位基因频率和单倍型频率;用家系样本、毛干样本DNA作为模板,检测Y-STR基因座的突变率和分析降解DNA的能力。在群体调查结果基础上,依据银染复合扩增位点选择的原则,选出符合条件的Y-STR基因座,通过优化复合扩增条件,建立复合扩增体系;扩增产物应用非变性聚丙烯酰胺凝胶连续缓冲体系垂直电泳分型、银染显色检测;用不同DNA含量样本、不同组织样本、不同载体上的血痕作模板,对复合扩增体系进行测试。结果1 Y-STR特异性分析结果应用e-PCR对10个基因座进行种属特异性分析,各基因座的DNA序列只与人类基因组DNA完全匹配,未见其他动物基因组DNA中存在相同序列;用10个Y-STR基因座的引物,扩增女性样本和常见动物样本DNA,均未检测到扩增产物。2电泳分型10个Y-STR基因座的扩增产物均只检测到一条带,非特异性产物少,分型效果良好。3等位基因测序结果10个Y-STR基因座除DYS588和DYS593外,其余均为简单重复序列Y-STR。它们在潮汕地区汉族人群中的扩增片段长度在108~372bp之间,其中DYS593扩增片段长度最小,DYS522最大。4群体遗传学数据潮汕地区汉族159名无关男性个体中,DYS522、YS549、DYS556、DYS565、DYS568、DYS570、DYS588、DYS593、DYS594、DYS598基因座分别检测出7、5、5、4、6、9、8、4、4、4个等位基因,基因变异度在0.1434 (DYS565)~0.7994 (DYS570)之间;10个Y-STR基因座,共观察到138种不同的单倍型,单倍型变异度为0.9973,标准误为0.00069。通过30个2代父子家系样本分析,10个Y-STR基因座单倍型一致,未观察到突变。5法医学应用结果10个Y-STR基因座中扩增片段长度小于130bp的DYS565、DYS568、DYS593、DYS598基因座,可对毛干DNA进行检测分型。6复合扩增结果选出了5个Y-STR基因座建立两组Y-STR复合扩增银染检测体系:MultiplexⅠ为DYS549、DYS556和DYS594,MultiplexⅡ为DYS570和DYS593;电泳结果显示:两组Y-STR银染复合扩增体系的各基因座间扩增产物平衡,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后可对其进行准确分型,且与单基因座扩增结果一致。法医学应用研究结果显示:两组复合扩增体系具有良好的男性特异性和较高的种属特异性,最低DNA检出量达0.5ng;同一个体不同组织器官DNA分型结果一致;对涂在不同载体上的血痕可进行分型,同一样本分型一致。经群体遗传学数据统计,5个基因座在潮汕地区汉族159名男性样本中共观察到97种单倍型,单倍型变异度为0.99,标准误为0.0013。结论1本研究筛选的10个Y-STR基因座都是单拷贝的Y染色体特异性STR基因座,具有很好的种属特异性和稳定的父系遗传,可用于法医学混合斑迹分析和父权关系的鉴定。2分析了10个Y-STR基因座的等位基因序列,调查了它们在潮汕地区汉族人群中的遗传多态性,为比较不同群体间的数据提供了依据,丰富了我国人类遗传学数据库。3 10个Y-STR基因座的单倍型变异度为0.9973,其构成的单倍型具有较高的个人识别率和非父排除率,能够有效提高Y染色体的鉴别能力。4证实了小于130bp的小片段MiniSTR可对毛干DNA进行检测分型,提示对于高度降解的DNA检材能够准确分型。5建立了两组Y-STR复合扩增银染检测体系:MultiplexⅠ和MultiplexⅡ;两组体系检测结果可靠,价格低廉;具有很好的男性特异性、种属特异性、系统重复性,灵敏度高;对附着在各种常见载体上的血痕具有良好的检测分析能力;个人识别率和非父排除率为0.99,为提高Y染色体的鉴别能力提供了一种经济、快速、高效的检测方法,可用于法医学实际检案。6本实验Y-STR复合扩增体系建立的方法,可作为其他Y-STR基因座银染和荧光复合扩增的参考依据。