漆酶是一种是含铜的多酚氧化酶,能氧化木质素及其结构相似物,木质素结构的复杂性,赋予了漆酶底物的多样性,能氧化多种酚类和非酚类化合物。目前,漆酶已被广泛地应用于造纸工业、纺织和染料工业、食品工业、生物合成和生物修复等领域。白腐真菌是漆酶的主要生产者,且同一真菌中普遍存在多个在动力学、理化特性上各异的漆酶同工酶,它们的表达存在时空特异性。本实验室在前期的研究中获得了一株高产漆酶耐热毛栓菌T.trogii S0301,该菌株漆酶粗酶液热稳定性高,且对碱、酸、有机溶剂和重金属离子具有较高的耐受性,具有一定的应用前景。目前T.trogii中只有两个漆酶基因(lcc1和lcc2)被克隆,且已纯化的T.trogii的漆酶存在热稳定性及离子耐受性较低等问题。基于此,本研究开展了如下研究:1、耐热T.trogiiS0301中6个漆酶基因的克隆及其表达分析根据漆酶铜结合保守区(CuI和CuIV)氨基酸序列设计兼并引物AsP1和AsP2,以耐热T.trogiiS0301基因组DNA为模板进行兼并PCR。经克隆得到lac1、lac7、lac13、lac16、lac50 和lac53 等 6 个不同的T.trogiiS0301 漆酶基因的部分序列。漆酶基因比对发现lac7与已报道的T.trogii 201 lcc2的相似性到达100%,lac7与T.trogii 201 lcc2应为同一个漆酶。此外,漆酶基因结构预测显示6个漆酶基因的部分序列中lac1、lac50和lac53的基因结构较相似;lac7和lac16的基因结构较相似;而lac13的内含子/外显子结构与其他T.trogii S0301漆酶基因差异较大。qRT-PCR分析发现T.trogii S0301各漆酶基因受外界条件的诱导效应各有差异,lacl、lac7、lac13、lac16、lac50和lac53的最高相对表达量分别为1155.8、506.1、9661.6、349.8、809.3和3071.7。6个漆酶基因的表达均受温度的诱导。Cu2+能诱导lacl和lac50的表达,但抑制lac13的表达,Cu2+对lac7、lac16和lac53的诱导效应不明显。当温度和2 mM Cu2+同时存在时,lacl和lac50表达均受到抑制。其可能原因是温度和2 mM Cu2+同时存在时对漆酶的表达存在拮抗作用。6个漆酶同工酶基因的表达受外界条件的调控各有差异,暗示着这六个漆酶基因在生物学功能上可能存在差异。2、lacl、lac13和lac50基因全长的克隆及其序列分析用TAIL-PCR对lacl、lac13和lac50全长基因进行克隆,并得到长度分别为2142 bp、2081 bp和2246 bp的lacl、lac13和lac50。lacl全长基因含有10个内含子,内含子长53-131 bp;lac13全长基因含有9个内含子,内含子长54-73 bp;lac50全长基因含有12个内含子,内含子长48-67 bp。在三个漆酶的预测氨基酸序列中所含的His、Cys和预测的N-糖基化位点的数目及位置各有差异。此外,在lac1、lac13和lac50的5’端上游调控区部分序列中含有种类、数目及位置不同的順式作用元件。这暗示了三个漆酶基因受外界条件的调控可能不同,T.trogii S0301 lac1、lac13和lac50漆酶基因表达分析也显示了这三个基因在不同外界条件下的表达差异较大。3、耐热T.trogii S0301漆酶蛋白纯化、酶性质分析及其脱色研究在本实验室前期优化的产酶培养基中获得的T.trogii S0301漆酶粗酶液,其漆酶活性高,热稳定性高,且对碱、酸、有机溶剂和重金属离子具有较高的耐受性。然而,粗酶液成分复杂,对酶特性的准确测定影响较大,为此,我们对T.trogii S0301漆酶同工酶进行了纯化,但只分离得到一个T.trogii S0301漆酶蛋白。纯化后的漆酶活性为352.1 U/mg。该漆酶分子量约为56 kDa,其最适温度和pH分别为45℃和3.0。该漆酶具有较高的热稳定性,在60℃和75℃的T1/2分别为3 h和10min,而且具有较高的金属离子耐受性,能耐受100mMCu2+、Zn2+、Mn2+和Co2+等金属离子。与其他已纯化的真菌漆酶相比,该漆酶对溴酚蓝、酸性红、结晶紫和孔雀绿具有较强的脱色能力。该漆酶在没有氧化介质下,在反映4 h后,该漆酶对结晶紫(25 mg/L)、酸性红(25 mg/L)、孔雀绿(10mg/L)和溴酚蓝(50mg/L)的脱色率分别为68.9%、77.3%、79.8%和96.4%。对高浓度溴酚蓝(125 mg/L),该漆酶也能有效地对其进行脱色。经MALDI-TOF MS及氨基酸序列同源性分析,发现纯化后漆酶的7个肽段与lac1的预测氨基酸序列具有100%的相似性,与lccl、lcc2、lac13和lac50的相似性分别为94.9%、74.8%、73.4%和65.5%。由此推断纯化得到的漆酶蛋白可能为lac1。4、耐热T.ogii S0301的漆酶lac13在酵母中的异源表达随着温度的上升,lac13表达量提高,并为所有基因表达量中的最高。T.trogii S0301 lac13与其它漆酶基因的转录调控的差异,暗示着lac13可能有着与其他漆酶不同的生物学功能。在T.trogii S0301漆酶同工酶纯化中,并没有分离出漆酶蛋白lac13。由此想通过lac13在酵母中的异源表达来获得大量的lac13及验证其功能。经G418抗性筛选,得到一株能抗G418浓度为3mg/mL的重组酵母。对重组酵母进行分子鉴定,发现在重组酵母基因组DNA中含有约1.5 kb的lac13 cDNA。重组酵母胞外液漆酶活性检测显示重组酵母的培养液中有漆酶活性,然而该重组酵母的漆酶产量较低。本研究对耐热真菌T.trogii S0301漆酶同工酶的表达、酶特性及其功能的研究,对推进真菌漆酶基因多样性和真菌漆酶的表达调控机制的研究,具有一定的影响。还可为漆酶在工业上的应用提供一定的理论依据。本文分离得到的lacl不仅具有较高的耐热性以及金属离子耐受性,对溴酚蓝、酸性红、结晶紫和孔雀绿还具有很强的脱色能力。表明了该漆酶在工业应用具有一定的应用前景。