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目的:矽肺是危害最为严重的一种职业性肺部疾病。在过去数十年里,世界各国采取多种途径来预防和控制矽肺病,但矽肺病发病率及患病率依旧逐年增加。矽尘在肺组织中的累积,是矽肺主要致病因素。沉积在肺内的矽尘颗粒将持续作用于肺组织,导致肺部慢性炎症和进展性肺组织纤维化。肺组织纤维化是不可逆的,矽肺患者肺功能会逐渐下降甚至衰竭,最终死亡。目前尚未找到矽肺病有效治疗手段,因而探讨矽肺病发病机制十分重要。我们先前研究表明阻断4-1BB信号通路可减轻矽尘所致肺部炎症及肺组织纤维化。然而,4-1BB表达在哪种细胞,以及其在矽肺发生发展中发挥的作用尚不清楚。因此,本研究首先探明4-1BB在矽尘暴露小鼠肺中表达情况。采用激活和抑制的干预方式,研究4-1BB信号通路对于巨噬细胞分泌促纤维化因子的调控作用,以及其在矽尘所致肺纤维化中调控机制。方法:本研究以C57BL/6小鼠和小鼠肺泡巨噬细胞系MH-S为研究对象,通过体内体外4-1BB信号通路干预实验,研究4-1BB信号通路对于矽尘暴露巨噬细胞分泌促纤维化因子的调控作用,以及阻断4-1BB信号通路对于矽尘所致肺组织中促炎和促纤维化因子的调控作用。1、流式细胞术将新鲜肺组织用剪子剪碎,加入组织裂解液,在摇床上孵育30 min。将组织悬液过70μm细胞筛网,收集悬液,4℃离心。用anti-CD137-PE、anti-F4/80-APC、anti-CD45-PerCP-Cy5.5、anti-CD11c-FITC、anti-CD137L-PE、anti-CD4-PerCP-Cy5.5、anti-CD44-FITC及anti-CD62L-APC流式荧光抗体进行胞外染色,室温避光孵育30min。staining buffer洗两遍。用300μL staining buffer重悬肺组织单细胞。在FACS Canto II机器上检测,用FlowJo V10 software软件分析。2、肺泡巨噬细胞纯化用10%水合氯醛麻醉小鼠,待小鼠死亡,用75%酒精给小鼠消毒。打开胸腔,剥离肺组织。将灌肺针插入气管内,注入1mL预冷无菌生理盐水,再缓慢抽出,反复10次。将收集的细胞悬液,4℃离心。用预热完全1640培养基重悬细胞。以每孔1×105个细胞铺在24孔细胞培养板中。孵育2 h后,贴壁细胞即为肺泡巨噬细胞。3、免疫印迹实验使用蛋白裂解液,提取巨噬细胞和肺组织蛋白。用BCA试剂盒测定蛋白浓度,并定量。每个孔道加入30μg样品。将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉,室温封闭1 h。之后加入大鼠抗CD137,兔抗ASK-1,兔抗p-ASK-1,兔抗p38,兔抗p-p38,兔抗-JNK,兔抗p-JNK,兔抗MMP9,兔抗MMP12和兔抗β-actin孵育,4℃过夜。漂洗后,加入相应二抗在室温下孵育2 h,使用ECL发光液进行检测。以β-actin作为内参。4、实时荧光定量PCR收集各组巨噬细胞。离心后,每管加入1 mL Trizol提取液,室温静置10 min。每管加入200μL氯仿,剧烈震荡15 s,室温静置2-3 min。4℃,12000 g/min,离心15 min,抽取无色上至新EP管中。每管加入500μL预冷异丙醇,颠倒混匀后,室温静置10 min。4℃,10000 g/min,离心10 min,弃上清。预冷75%DEPC酒精洗两遍。4℃,7500 g/min,离心10 min,弃上清。室温干燥沉淀2 min,根据沉淀量加入适量无RNase的水,吹打均匀。测定RNA浓度。使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA模板,用SYBR Green法配制扩增体系。使用ABl7500进行荧光定量检测。以GAPDH作为ΔCT值标准化内参。采用2-△△CT法计算各基因相对表达量。5、酶联免疫吸附实验收集细胞培养上清,2000 rpm离心10 min。将上清液,转移至新EP管中,保存在-80℃冰箱中,用于后续检测。将不同组小鼠肺组织裂解液稀释至浓度为1μg/μL,保存于-80℃备用。按照ELISA试剂盒操作说明,检测IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的含量。6、免疫组织化学实验将肺组织切片放在60℃烘箱中,烘烤2 h。肺组织切片在二甲苯及梯度酒精中逐渐复水化。之后在95℃柠檬酸盐缓冲液（pH 5.9-6.2）中进行抗原修复,加热持续20 min。待片子冷却后,用3%H2O2封闭切片。之后滴加含有MMP9、MMP12或胶原蛋白Ⅰ的一抗,放在湿盒中,4℃过夜。用PBS洗3次/5 min。甩干片子,滴加二抗,室温下孵育2 h。使用DAB试剂盒进行染色,用苏木素染核。中性树胶封片。7、统计分析统计结果表示为均数±标准误（mean±SEM）。数据采用SPSS 19.0统计学软件进行分析。运用t检验,比较两组间差异（方差齐时使用t检验,方差不齐时使用矫正t检验）;多组间的比较采用单因素方差分析,当差异存在统计学意义时,使用SNK法进行组间比较。当P﹤0.05,具有统计学意义。结果:1、矽尘暴露小鼠肺泡巨噬细胞4-1BB表达增加流式细胞术检测各组小鼠肺中肺内巨噬细胞及CD4+T细胞4-1BB表达情况。矽尘暴露早期,与对照组相比,矽尘暴露组小鼠肺中肺泡巨噬细胞比例有所增加,且肺泡巨噬细胞表达4-1BB及4-1BBL比例有所增加（P<0.05）;而肺中肺间质巨噬细胞比例有所下降,肺间质巨噬细胞表达4-1BB及4-1BBL比例没有明显变化（P<0.05）。与对照组相比,矽尘暴露组小鼠肺中效应T细胞比例有所增加,效应T细胞表达4-1BB比例未发生改变（P<0.05）;而肺中初始T细胞比例有所下降,初始T细胞表达4-1BB比例没有明显变化（P<0.05）。2、矽尘可诱导小鼠肺泡巨噬细胞系MH-S表达4-1BB运用流式细胞术、Western blot、和Realtime-PCR方法,检测给予矽尘处理后,小鼠肺泡巨噬细胞系MH-S中4-1BB蛋白及mRNA表达情况。结果显示,矽尘可诱导巨噬细胞表达4-1BB（P<0.05）。3、激活4-1BB信号通路可促进矽尘暴露巨噬细胞分泌促炎和促纤维化因子Western blot结果显示,与单独矽尘暴露组相比,以4-1BB mAb（10μg/mL）处理的矽尘暴露组巨噬细胞中ASK-1及其下游p38和JNK磷酸化显著水平升高（P<0.05）,而不影响总ASK-1、p38和JNK表达。Realtime-PCR结果显示,与单独矽尘暴露组相比,以4-1BB mAb（10μg/mL）处理的矽尘暴露组巨噬细胞MMP9和MMP12 mRNA的表达水平显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。以4-1BB mAb（10μg/mL）处理的矽尘暴露组同单独矽尘暴露组巨噬细胞相比,MCP-1 mRNA的表达水平显著增加（P<0.05）。ELISA方法检测各组巨噬细胞培养上清中促炎和促纤维化细胞因子的含量。结果显示,与单独矽尘暴露组相比,以4-1BB mAb（10μg/mL）处理的矽尘暴露组巨噬细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。4、阻断4-1BB信号通路可抑制矽尘暴露巨噬细胞分泌促炎和促纤维化因子Western blot结果显示,与单独矽尘暴露组相比,经4-1BBIg、NQDI 1以及沉默4-1BB基因处理的矽尘暴露组巨噬细胞中ASK-1及其下游p38和JNK磷酸化水平明显降低（P<0.05）,而不影响总ASK-1、p38和JNK表达。Realtime-PCR的结果显示,与单独矽尘暴露组相比,经4-1BBIg、NQDI 1及沉默4-1BB基因处理的矽尘暴露组巨噬细胞MMP12 mRNA的表达水平显著降低（P<0.05）。NQDI 1可下调矽尘暴露组巨噬细胞MMP9 mRNA的表达水平（P<0.05）,而4-1BBIg和沉默4-1BB基因对于矽尘暴露组巨噬细胞MMP9 mRNA表达水平没有影响。以NQDI 1和沉默4-1BB基因处理的矽尘暴露组巨噬细胞MCP-1 mRNA的表达水平明显下降（P<0.05）。而4-1BBIg使矽尘暴露组巨噬细胞MCP-1 mRNA表达水平升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。NQDI 1可有效抑制矽尘暴露组巨噬细胞分泌促炎及促纤维化细胞因子IL-1β和TNF-α（P<0.05）。沉默4-1BB基因可抑制矽尘暴露组巨噬细胞分泌IL-1β和TNF-α（P<0.05）。经4-1BBIg处理的矽尘暴露组巨噬细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌增加（P<0.05）。5、阻断4-1BB信号通路可减少矽尘暴露小鼠肺组织中促炎和促纤维化因子的分泌与单独矽尘暴露组相比,给予100μg 4-1BBIg处理的矽尘暴露组小鼠肺组织中p38和JNK磷酸化水平显著降低,而总p38和JNK表达不受影响。而给予50μg 4-1BBIg时,p38和JNK磷酸化水平受到不同程度影响,总p38和JNK表达不变。Western blot结果显示,与单独矽尘暴露组相比,给予100μg 4-1BBIg处理的矽尘暴露组小鼠肺组织中MMP9和MMP12蛋白表达显著下降（P<0.05）;而当给予50μg4-1BBIg时,矽尘暴露组小鼠肺组织中MMP9和MMP12蛋白表达没有显著变化。ELISA结果显示,给予100μg 4-1BBIg处理的矽尘暴露组小鼠肺组织中IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著降低（P<0.05）,而MCP-1的含量没有明显变化;给予50μg 4-1BBIg处理的矽尘暴露组小鼠肺组织中TNF-α含量有所下降,差异具有统计学意义（P<0.05）,而IL-1β、IL-6和MCP-1没有变化。免疫组织化学染色和Western blot结果显示,在矽尘暴露后第7天和第56天,给予NQDI 1处理的矽尘暴露组小鼠肺组织中MMP9和MMP12的表达显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。免疫组织化学染色结果显示,在矽尘暴露晚期,与单独矽尘暴露组相比,给予NQDI 1处理的矽尘暴露组小鼠肺组织中Ⅰ型胶原蛋白表达明显减少。结论:1、矽尘可诱导巨噬细胞表达4-1BB。2、4-1BB信号通路可调控巨噬细胞分泌促炎及促纤维化细胞因子、趋化因子及金属基质蛋白酶。3、阻断4-1BB信号通路可减少矽尘暴露小鼠肺组织中促炎和促纤维化因子的分泌,进而减轻肺组织纤维化。