B类G蛋白偶联受体(GPCR)属于GPCR家族中的分泌素家族,包括15种不同类型的受体,其在体内的天然配体为多肽类激素。B类家族GPCR在体内发挥重要生物学功能,其功能失调会导致肥胖症、癌症、神经性退化病、骨类疾病和心血管疾病等众多疾病的发生,因此它们也是临床治疗的重要靶标受体。虽然越来越多的科研人员投入到对该类GPCR的结构与功能研究当中,但是对该类家族全长受体结构尤其是激活态结构及受体激活机制的研究进展仍然相对缓慢,严重制约了人们对该家族如何与多肽相互作用以及如何激活下游信号通路的理解。本论文将主要通过以下四章的内容阐明我们对该重大科研问题的新见解。在第一章引言中,我们概述了目前B类GPCR结构及生化研究现状,同时也阐述了该工作的亮点及解决的主要科学问题。在论文第二章中,我们从具体B类GPCR入手,以胰高血糖素样肽I受体(GLP-1R)为研究对象,从功能学角度阐述GLP-1R的ECD在受体激活过程中发挥的作用及具体机制。通过运用全长受体突变、串联多肽、截短多肽和共表达等方法,我们发现分开表达的GLP-1R的ECD和TMD在全长多肽的激活下会发生直接相互作用,并介导下游信号通路激活。进一步通过突变实验,证实了ECD与TMD的作用界面位于EC1(第一胞外环),EC2和EC3上。该发现颠覆了对传统B类GPCR“两域”激活模型的认识,提出B类GPCR的ECD和TMD在多肽激活过程中并非相对独立,而具有直接相互作用的新机制,因此该研究引起了对于B类GPCR激活时ECD与TMD如何相互作用及构象如何变化等一系列问题的大讨论。在论文第三章中,我们以同属B类GPCR的胰高血糖素受体(GCGR)为研究对象,结合结构模型与突变实验,探讨了B类GPCR在激活态与非激活态之间转变的机制。研究发现,GCGR上位于TM5(第五跨膜段)、TM6以及连接两者的IC3(第三胞内环)上彼此相对的四个氨基酸(L329,L333,,M338和F345)形成一个疏水口袋,该口袋对维持TM6乃至整个受体的非活性构象至关重要,分别突变该区域的四个氨基酸,特别是突变位于TM6的F345和位于IC3的M338,单点突变即导致受体的非活性状态解除,产生较强的非依赖于多肽的自我激活效应。但是我们发现该激活机制只适用于GCGR。进一步研究发现,位于TM6的T351、TM2的H177、TM3的E245和TM7的Y400形成一个非常保守的极性中心口袋(T351与Y400之间形成氢键,E245与H177之间形成氢键),破坏该极性口袋中的氢键作用会导致GCGR发生自我激活效应。基于上述结果,我们提出了GCGR激活的机制模型,即TM6被疏水区域和保守极性口袋固定在非活性构象,突变破坏这两个结构域会导致TM6向远离中心区域移动而处于激活构象。该极性口袋的重组在其他B类GPCR,如甲状旁腺激素受体(PTH1R)、血管活性肠肽I受体(VIP1R)、垂体腺苷酸环化酶激活多肽受体I(PAC1R)和促肾上腺皮质激素释放因子受体(CRF1R)等中普遍存在。这一B类GPCR激活的通用机制拓展了我们对于B类GPCR激活与未激活机制的理解,同时也为未来开发靶向这些受体的药物奠定了基础。在论文第四章中,我们以甲状旁腺激素受体(PTH1R)为研究对象,试图探索该药物靶点的三维结构,希望能从晶体学角度回答关于B类GPCR激活机制的问题。由于全长PTH1R蛋白性质及表达量都无法满足结晶要求,因此我们首先从PTH1R跨膜段入手。为了得到被多肽激活的跨膜段受体结构,我们创新性的将PTH多肽串联在跨膜段受体的N端,并通过引入二硫键,筛选新型去垢剂等方法,使其处于稳定的激活构象。进一步通过优化表达质粒、纯化条件和结晶条件等等一系列优化改造,获得了表达性状良好,且维持受体激活态的融合蛋白及一些有希望的小晶体类似物,为进一步结晶以及靶向PTH1R的骨质疏松症小分子药物开发奠定基础。