研究背景和目的胎粪吸入综合征(Meconium aspiration syndrome, MAS)是新生儿期常见呼吸系统危重疾病之一,常见于足月儿和过期产儿。国外流行病学报道,MAS发病率为活产新生儿1.2～2.0%,病死率为3-12%。胎儿宫内窘迫或产时窒息排出胎粪,胎粪吸入后到达各级气管、支气管及肺泡,造成气道阻塞、炎症细胞浸润、炎症因子大量释放、肺表面活性物质失活,导致急性肺损伤(Acute lung injury,ALI),严重者可继发肺水肿、肺出血、呼吸衰竭、肺动脉高压及多脏器功能损害。MAS导致的ALI是一个多因素共同作用的复杂过程,目前公认,炎症因子、氧化应激损伤、细胞凋亡等参与了ALI的发生、发展。细胞外信号通过信号通路向细胞核内传递,调控多种细胞因子基因和蛋白的表达。因此,深入研究MAS导致的ALI的信号通路,寻找调控ALl的关键通路及恰当的干预药物,有助于为临床药物治疗提供新的思路。目前国内外多采用成年大鼠、成年豚鼠、新生兔、新生猪等体积较大的动物作为实验动物,用气管切开气管插管的方法建立MAS动物模型,存在一些问题。首先,成年动物组织器官已发育成熟,无法充分体现胎粪吸入后新生儿各组织器官改变的病理生理过程。其次,气管切开操作复杂,不易掌握。第三,气管切开损伤大,插管后需呼吸机辅助呼吸,可能造成应激性肺损伤影响实验结果,实验过程复杂、建模成功率低,重复性差。我们选择日龄14～21天的新生大鼠作为实验对象,参照小鼠无创直视下经口气管插管的方法,建立新生大鼠MAS模型,同时建立气管切开气管插管组作为对照,通过比较建模成功率、肺组织湿干重比、病理评分,评估哪种方法更适宜。我们使用不同浓度的胎粪混悬液,根据大鼠肺病理损伤结果,探讨建立新生大鼠MAS导致的急性肺损伤模型合适的胎粪浓度。肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)在MAS的发展过程中具有重要的作用,是MAS病理过程中释放最早、最重要的细胞因子之一,除了自身具有强大的炎症作用外,还具有启动出发多种炎症因子的作用。胎粪吸入可直接激活包括TNF-a在内的多种细胞因子,造成氧化应激损伤,促进肺组织内多种细胞的凋亡。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase, MAPKs)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,通过磷酸化相应细胞蛋白,调节转录因子活性,启动有关细胞因子和炎性介质的基因表达。MAPKs级联激活是多种信号通路的中心,接收膜受体转换与传递的信号,并将其带入细胞核内,在许多细胞增殖相关信号通路中具有关键作用。MAPK通路主要包括P38通路、JNK通路、ERK1/2通路、ERK5通路。哺乳动物中,ERK1/2通路广泛存在于各种组织,参与细胞的增殖分化的调控。多种生长因子受体、营养相关因子受体等都需要ERK通路的活化来完成信号转导过程。JNK通路是细胞对各种应激原诱导的信号转导的关键分子,参与细胞应激反应。p38通路介导炎症、细胞凋亡等。因此MAPKs信号通路在MAS引起的ALI的发生、发展中具有极其重要作用。磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)是细胞内信号转导的重要物质,参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt,亦称为蛋白激酶B(Protein Kinase B, PKB),是P13K下游主要的效应物,通过下游多种通路对靶蛋白进行磷酸化,可激活蛋白的翻译,增强细胞的生长,具有抗凋亡作用。西地那非是选择性5型磷酸二酯酶(Phosphodiesterase-5, PDE5)抑制剂,能抑制环磷酸鸟苷(Cyclic guanosine monophosphate, cGMP)的水解,提高cGMP浓度,从而使选择性舒张肺血管,降低肺动脉压力,已列入MAS继发肺动脉高压治疗指南。近年研究发现,西地那非同时具有改善氧化应激和抑制细胞凋亡的作用,目前已在急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺缺血再灌注等方面开展很多相关研究,但对MAS早期ALI的干预作用及可能机制国内外尚未见相关研究。MAS导致ALI是复杂的变化过程,各种刺激如炎症介质、细胞因子等共同作用,其中多种信号通路相互影响,相互制约。我们通过直视下气管插管,建立新生大鼠胎粪吸入急性肺损伤模型,以目前公认对ALI有效的地塞米松做对照,通过观察病理损伤、炎症因子、细胞凋亡等情况,研究西地那非对MAS导致的ALI的作用,同时探讨p38.MAPK.ERK 1/2.MAPK.JNK.MAPK.P13k/Akt信号通路在ALI中的作用,并探讨西地那非对信号通路的调节作用。本实验分为三部分：第一部分直视下经口气管插管建立新生大鼠胎粪吸入急性肺损伤模型第二部分西地那非对胎粪吸入诱导新生大鼠急性肺损伤保护作用的研究第三部分胎粪吸入诱导新生大鼠急性肺损伤信号通路及西地那非作用的研究研究方法第一部分48只健康雄性新生Wistar大鼠,日龄14～21天,随机分为气管切开组(A组)18只、直视下气管插管组(B组)24只、正常对照组(C组)6只；B组分为生理盐水对照组(BN组)、低浓度胎粪组(BL组)、中浓度胎粪组(BM组)、高浓度胎粪组(BH组),每组6只。A、B组大鼠苯巴比妥钠腹腔麻醉,A组气管切开,插管后呼吸机辅助呼吸；B组直视下经口气管插管,1分钟拔管,自主呼吸。胎粪剂量均为2ml/mg,胎粪浓度:A组40mg/ml,BL组30mg/ml,BM组60mg/ml,BH组90mg/ml,BN组气管内注入生理盐水2m1/kg。气管内注入后6小时观察各组建模成功率,麻醉后处死,取肺组织HE染色观察病理评分及测定湿/干重比。第二部分24只新生健康雄性western大鼠,日龄14～21天,随机分为生理盐水对照组(C组)、胎粪吸入组(M组)、地塞米松组(D组)、西地那非组(S组),直视下气管插管,气管内注液2ml/kg,C组注入生理盐水,其余三组注入胎粪,浓度为60mg/L。气管内注液后30分钟插胃管,胃管内注液2ml/kg, C组、M组注入生理盐水,S组注入西地那25mg/kg、D组注入地塞米松1mg/kg。6小时后E LISA法检测血清TNF-a、cAMP、cGMP含量；取肺组织HE染色病理评分；检测MPO、SOD活性、MDA、NO含量；TUNEL法检测细胞凋亡；免疫组化法及Western blot检测Bcl-2、Bax蛋白的表达；qRT-PCR检测]NF-a、Bcl-2、Bax基因的表达。第三部分48新生健康雄性western大鼠,日龄14～21天,随机分为8组,生理盐水对照组(C组)、胎粪吸入组(M组)、西地那非组(S组),ERK抑制剂组(PD组)、P38抑制剂组(SB组)、JNK抑制剂组(SP组)、PI3K抑制剂组(W组),因各组抑制剂均用二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解,故设立溶剂对照组DMSO组(D组)。各组予腹腔注射,剂量5ml/kg, C组、M组、S组为磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution, PBS);其余组用PBS稀释试剂至相应浓度。SB组注射SB203580,剂量1mg/kg; PD组注射PD95809,剂量10mg/kg;SP组注射SP600125,剂量6mg/kg; W组注射VVortmannin,剂量1mg/kg; D组注射DMSO:剂量50mg/kg。各组抑制剂剂量见参考文献,并经预实验。腹腔注射后1小时气管插管,C组注入生理盐水,其余组注入浓度为6Omg/ml胎粪混悬液,均为2ml/kg。气管内注液后30分钟插胃管,S组注入西地那非25mg/kg (生理盐水稀释浓度为12.5mg/ml),其余组注入生理盐水,均为2ml/kg。为防止吸氧影响实验结果,实验过程中未予吸氧。6小时后取肺组织HE染色观察病理结果,ELISA法检测血清TNF-a浓度,免疫组化法及Western blot检测p-P38、p-JNK、 p-ERK1/2及p-Akt蛋白的表达。统计学处理采用SPSS19.0统计软件进行分析,计数资料以均数±标准差(x±s)表示,所有数据均进行方差齐性检验,组间均数比较用单因素方差分析(One-Way ANOWA),其后进行两两比较,采用LSD检验；分类资料进行卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果第一部分1建模成功率A组18只大鼠中,3只(3/18)成活到气管插管后6小时,建模成功率16.67%。B组22只(22/24)建模成功,成功率91.67%。BH组死亡2只。两组建模成功率比较X=24.01,差异有统计学意义(p<0.01)。2肺组织湿/干重比各组大鼠肺组织湿/干重比差异有统计学意义(F=24.48,P<0.01)。与C组相比,BN组略高,但差异无统计学意义(P>0.05)；然后由低至高依次为BL组、BM组、A组,BH组,组间差异有统计学意义(P<0.05)；BH组最高,但与A组差异无统计学意义(P>0.05)。3病理结果各组大鼠肺组织病理评分差异有统计学意义(F=51.31,P<0.01)。C组最低,然后是BN组,但两组差异无统计学意义(P>0.05)；BL组、BM组均高于BN组(P<0.05),BM组高于BL组(P<0.01),低于BH组及A组(P<0.05),差异均有统计学意义；A组最高,但与BH组差异无统计学意义(P>0.05)。第二部分1 病理评分各组间病理评分差异有统计学意义(F=14.46,P<0.01)。M组最高,高于D组、S组(P<0.05),C组(P<0.01),D组、S组高于C组(P<0.01),D、S两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。2氧化应激及炎症因子M组MPO、NO、MDA浓度最高,高于D组、S组、C组(P<0.01),D组、S组高于C组(P<0.01)。M组SOD浓度最低,低于C组、D组、S组(P<0.01),C组低于D组、S组(P<0.01);D、S两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。TNF-a浓度及基因：M组最高,高于C组、D组、S组(P<0.05),D组、S组高于C组(P<0.01)。3细胞凋亡M组凋亡指数(TU-NEL法)、Bax蛋白和基因的表达最高,高于C组、D组、S组(P<0.01),D组、S组高于C组(P<0.01)；C组Bcl-2/ax蛋白和基因、Bcl-2蛋白和基因的表达最低,低于M组、D组、S组(P<0.01),M组低于D组、S组(P<0.01)；D、S两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。4血清cAMP？cGMP浓度D组cAMP最高,高于S组、M组、C组(P<0.01),S组高于M组(P<0.05)、C组(P<0.01),M组高于C组(P<0.05)；S组cGMP最高,D组高于M组及C组(P<0.01),M组、C组差异无统计学意义(P>0.05)。第三部分1 病理评分SB组、SP组和S组炎症表现较轻,M组、D组、W组及PD组炎症表现较重。各组间病理评分差异有统计学意义(F=28.23,P<0.01)。SB组、SP组和S组较C组升高(P<0.01),较M组降低(P<0.01),三组之间差异无统计学意义；PD组、W组和D组,较C组升高(P<0.01),与M组差异无统计学意义(P>0.05)。由此可见,给予P38、JNK抑制剂及西地那非后病理评分下降,而给予ERK1/2、PI3K抑制剂后病理损伤无减轻。2血清TNF-a浓度检测各组间差异有统计学意义(F=31.87,P<0.01)。SB组、SP组、S组较C组升高(P<0.01),较M组降低(P<0.01),三组之间差异无统计学意义；PD组和W组较M组升高(P<0.05),两组间差异无统计学意义(P>0.05)。由此可见,给予P38、JNK抑制剂及西地那非后血清TNF-a浓度下降,而给予ERK1/2、P13K抑制剂后血清TNF-α升高。3肺组织中p-P38、p-ERK1/2、p-JNK及p-Akt蛋白的表达3.1 p-P38蛋白的表达免疫组化法检测显示,胎粪刺激后M组可见p-P38阳性细胞增多,尤其在浸润的中性粒细胞中多见。给予P38抑制剂及西地那非后,均可见p-P38阳性细胞减少。Western blot检测显示,组间差异有统计学意义(F=48.28,P<0.01)。SB组和S组较C组升高(P<0.01),较M组、D组降低(P<0.01),SB组和S组之间差异无统计学意义。3.2 p-ERK1/2蛋白的表达正常对照组可见少量阳性细胞,胎粪刺激后,M组、D组呈阳性表达,主要为中性粒细胞、血管内皮细胞等,在细胞浆及细胞核内可见棕黄色颗粒沉积。ERK1/2抑制剂干预后,p-ERK1/2蛋白表达明显减少；西地那非干预后,p-ERK1/2蛋白呈强阳性表达。Western blot检测显示,各组间差异有统计学意义(F=124.28,p<0.01)。PD组与C组差异无统计学意义p>0.05),低于M组、D组(p<0.01)；S组高于M组及D组(p<0.05)3.3 p-JNK蛋白的表达免疫组化检测显示,西地那非及JNK抑制剂干预后,肺组织内p-JNK表达很弱,与C组相似,M组、D组可见阳性表达,表现为细胞浆内及部分细胞核内棕黄色。Western blot检测显示,组间差异有统计学意义(F=119.96,p<0.01)。C组、SP组、S组肺组织p-JNK表达差异无统计学意义(p>0.05),均低于M组、D组 (p<0.01)。3.4 p-Akt蛋白的表达免疫组化结果显示,C组及P13K抑制剂作用后新生大鼠肺组织可见弱阳性表达,W组、D组呈阳性表达,给予西地那非后S组可见阳性表达明显,细胞内见棕黄色颗粒。Western blot检测显示,差异有统计学意义(F=57.26,p<0.01)。C组和W组最低；S组高于M组、D组,差异有统计学意义p<0.01)。研究结论1 传统的气管切开气管插管方法对新生大鼠组织损伤大,操作复杂,需要小动物呼吸机辅助呼吸,建模成功率低,并可导致应激性肺损伤,影响实验结果。我们通过直视下经口气管插管建立新生大鼠胎粪吸入模型,建模成功率高,无应激性肺损伤。同时确定浓度为60mg/ml的胎粪混悬液可导致新生大鼠肺组织典型而广泛的病理改变。2炎症因子、氧化应激损伤和细胞凋亡参与了胎粪吸入诱导新生大鼠急性肺损伤的发病机制；西地那非可抑制炎症因子的表达,减轻氧化应激损伤；增加Bcl-2的表达,减少Bax的表达,降低Bcl-2/Bax匕值,从而抑制细胞凋亡,减轻MAS导致的ALI的病理损伤。西地那非可能通过增加cGMP和cAMP的活性发挥生物学效应。3 MAPKs信号通路中的P38、ERK1/2、JNK、及I3K/Akt信号。通路均参与了新生大鼠MAS诱导的ALI的病理过程。P38 MAPK通路和NK MAPK通路可能通过增加炎症因子TNF-a的表达加重肺组织病理损伤,ERK1/2 MAPK通路和PI3K/Akt通路可减少TNF-a的表达从而减轻病理损伤。西地那非在MAS诱导新生大鼠ALI的动物模型中,可影响信号通路,抑制肺组织p-P38及p-JNK蛋白的表达,增加p-ERK1/2和p-Akt蛋白的表达,具有一定的肺保护作用。创新及意义1 本研究通过直视下经口气管插管建立新生大鼠胎粪吸入模型,建模成功率高,无应激性肺损伤。同时确定浓度为60mg/ml的胎粪混悬液适宜用来建立新生大鼠MAS模型。2本研究明确西地那非通过减轻氧化应激、减少炎症因子的表达,抑制细胞凋亡等对MAS诱导新生大鼠ALI具有肺保护作用,为临床使用西地那非治疗ALI提供理论依据。2本研究明确了MAPKs (P38、JNK、ERK1/2)及PI3K/Akt信号通路均参与了新生大鼠MAS诱导的ALI的病理过程,P38 MAPK通路和.fNK MAPK通路可增加炎症因子TNF-a的表达加重肺损伤,ERK1/2 MAPK通路和PI3K/Akt通路可减少TNF-a的表达从而减轻病理损伤。西地那非可抑制肺组织p-P38及p-JNK蛋白的表达,增加p-ERK和p-Akt蛋白的表达,具有一定的肺保护作用。选择性的信号通路抑制剂有望成为临床治疗的新方向。