研究背景:乳腺癌是全球常见的恶性肿瘤之一,也是导致女性死亡的重要原因之一。作为一种异质性疾病,其以不同的激素受体表达状态为特征,而这些特征也常用于预测乳腺癌不同亚型的靶向治疗。目前,临床上已有多种治疗乳腺癌的靶向药物,如雌激素受体(ER)靶向药物--他莫昔芬、HER2靶向药物--曲妥珠单抗。以上靶向药物虽然可有效抑制乳腺癌的演进,但侵袭和转移仍是导致乳腺癌患者死亡的主要病因。因此,深入探究乳腺癌侵袭转移的相关调控基因及分子通路作用机制,将有利于明确乳腺癌的早期诊断及治疗靶点,对改善乳腺癌的个体化治疗及改善患者的预后具有重要临床价值。醌氧化还原酶(NAD(P)H:quinone oxidoreductase-1,NQO1),也被称为DT-硫辛酰胺脱氢酶,定位于染色体16p22。它通过受体NAD(P)H催化醌类及其衍生物,使其失去双电子发生还原反应,避免了对细胞的损伤。值得注意的是,当NQO1cDNA609位点发生突变时可导致细胞解毒致癌物的能力降低,增加致癌物的作用,导致某种易感个体发生恶性病变,从而增加个体罹患多种恶性肿瘤的危险。近年来,NQO1在多种恶性肿瘤中所扮演的角色备受学者的关注。Ma等研究显示,NQO1在正常宫颈组织中表达较低,但在宫颈癌组织中表达异常,并与宫颈癌的分化程度、临床分期、淋巴结转移密切相关。Zhang等研究发现,NQO1通过激活AMPK/PGC-la信号通路抑制肝癌细胞的增殖并诱导凋亡。此外,Cheng等研究显示,NQO1通过糖代谢重编程促进非小细胞肺癌的增殖,且沉默NQO1可触发PDHX、PDK4非依赖性的三羧酸循环。以上研究均表明,NQO1是一个癌基因,其高表达与多种肿瘤的发生发展密切相关。我们前期研究发现,NQO1可作为乳腺癌患者的早期诊断及预后评估指标,但其在乳腺癌恶性演进过程中的作用及具体机制尚不明确。因此,本文亟待研究NQO1对乳腺癌生物学行为的影响及作用机制,从而为乳腺癌的靶向治疗提供可靠、有效的理论与实验依据。研究目的:明确NQO1/PKLR信号轴通过糖代谢重编程调控乳腺癌增殖、EMT进程的相关分子机制。(1)研究NQO1过表达在乳腺癌中的临床病理学意义,为乳腺癌治疗提供可能的有效分子靶点;(2)明确NQO1对乳腺癌细胞生长、转移、糖代谢重编程等生物学功能的影响,并初步阐明其可能的分子作用机制;(3)揭示NQO1与糖代谢基因PKLR的相关性,明确NQO1/PKLR信号轴调控乳腺癌进程的相关机制。材料与方法:(1)组织标本及数据库分析:通过检索TCGA、GDS数据库分析NQO1在乳腺癌组织中mRNA水平的表达情况;通过TCGA、The Human Protein Atlas数据库挖掘并获取NQO1的表达在乳腺癌患者临床预后评估中的意义;采用免疫组织化学方法检测NQO1和PKLR在乳腺癌组织及正常组织中的表达,且分析两者之间的相关性。(2)体外实验:利用慢病毒载体转染人乳腺癌细胞分别建立NQO1沉默和高表达稳转细胞系,小分子干扰RNA(siRNA)敲低人乳腺癌细胞中PKLR基因的表达;应用噻唑蓝实验、平板克隆实验、EdU增殖实验检测NQO1不同处理后对乳腺癌细胞增殖能力的影响;应用划痕实验、迁移实验和浸润实验检测NQO1对乳腺癌细胞迁移、浸润能力的影响;采用代谢相关试剂盒检测NQO1对乳腺癌细胞的葡萄糖、乳酸消耗能力及ATP生成能力的影响。利用Western blot实验和免疫荧光实验分析其对转移相关途径EMT的上皮及间质标志物蛋白的表达情况。应用Western blot实验检测NQO1不同表达情况下对糖代谢相关标志物蛋白(G6PC、PKM2、HK3)水平的影响。通过免疫共沉淀实验明确NQO1与PKLR之间的分子机制。(3)体内实验:将不同组别的乳腺癌细胞分别接种于裸鼠双侧腋窝皮下建立皮下移植瘤模型,并对比NQO1转染前后裸鼠皮下成瘤及增殖情况;同时,通过裸鼠尾静脉注射建立体内转移瘤模型,并对比NQO1转染前后裸鼠的肺部转移情况;进一步应用免疫组织化学方法测定各组裸鼠肿瘤组织中Ki67、NQO1、PKLR、E-cadherin、Vimentin等蛋白的表达水平,并对实验裸鼠肺组织进行苏木素--伊红染色,明确肺转移情况。结果:(1)NQO1高表达与乳腺癌患者的不良预后密切相关:NQO1主要表达于乳腺癌细胞的细胞核和细胞浆;TCGA、GSE等数据库显示NQO1在乳腺癌中呈高表达,NQO1在乳腺癌组织中的阳性表达率(85.5%)显著高于其在乳腺良性组织中的表达(27.4%),且其高表达与乳腺癌患者的临床分期、分化程度、淋巴结转移、Her2密切相关;TCGA、The Human Protein Atlas数据库检索分析显示,其高表达预示乳腺癌患者的不良预后。(2)NQO1促进乳腺癌的增殖:通过MTT和克隆形成实验,我们发现NQO1高表达可促进乳腺癌细胞的增殖能力;EdU增殖实验表明NQO1可调控细胞的DNA复制能力;体内实验进一步证实NQO1高表达可促进裸鼠皮下成瘤能力。(3)NQO1通过介导EMT途径促进乳腺癌细胞的迁移、浸润:划痕及Transwell实验表明NQO1高表达显著增强乳腺癌细胞的迁移、浸润能力;当NQO1沉默可显著上调上皮标志物(E-cadherin和ZO-1)的表达,同时下调间质标志物(Vimentin,Snail,Slug等)的表达情况;反之,NQO1高表达则下调上皮标志物的表达,上调间质标志物的表达。进一步的体内实验表明,NQO1沉默处理后可显著减少肺转移情况,而NQO1高表达则促进乳腺癌细胞的肺转移情况。(4)NQO1通过糖代谢重编程调控乳腺癌细胞的恶性进展:敲除NQO1可显著减少乳腺癌细胞的葡萄糖利用情况、乳酸、ATP生成情况及代谢标志物(G6PC、PKM2、HK3)的蛋白表达水平,而NQOl过表达则显著提升乳腺癌细胞对葡萄糖的利用情况、乳酸及ATP生成情况,同时上调代谢标志物的表达水平。更重要的是,予以糖代谢抑制剂(2-DG、3-BrPA)处理后,不仅抑制了乳腺癌细胞的增殖、迁移及浸润能力,同时抑制了 NQO1诱导的EMT进程(减少Vimentin等间质标志物的表达,增加E-cadherin的蛋白表达水平)。(5)NQO1/PKLR信号轴参与调控乳腺癌的增殖、EMT进程及糖代谢重编程:免疫共沉淀实验表明,NQO1以PKLR作为下游靶蛋白,从而调控乳腺癌的相关进程;小干扰RNA技术沉默PKLR后可显著抑制NQO1诱导的乳腺癌细胞的增殖、迁移和浸润能力。同时,Western blot实验表明PKLR沉默上调E-cadherin的表达水平、下调Vimentin等间质标志物及G6PC等代谢标志物的表达水平,说明沉默PKLR基因可有效抑制NQO1所诱导的糖代谢重编程及EMT进程。此外,免疫组织化学染色结果显示,NQO1与PKLR的表达水平在乳腺癌组织及细胞中呈显著的正相关。这些结果提示NQO1/PKLR信号轴在乳腺癌细胞的恶性进展中发挥关键作用。结论:(1)NQO1高表达与乳腺癌患者的临床分期、分化程度、淋巴结转移情况、Her2密切相关,并预示乳腺癌患者的不良预后。(2)NQO1高表达通过EMT途径促进乳腺癌细胞的转移。(3)NQO1高表达参与调控乳腺癌的糖代谢重编程,且通过糖代谢重编程抑制乳腺癌细胞的增殖及EMT进程。(4)NQO1/PKLR在乳腺癌的发生发展过程中扮演着重要的角色,且主要通过糖代谢重编程调控乳腺癌的增殖和转移。