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一氧化氮(NO)作为一种发现的神经递质，在视觉信息的处理、传导、细胞间反馈调节中起重要作用。一氧化氮可以通过激活可溶性鸟苷酸环化酶，产生第二信使环化一磷酸鸟苷(cGMP)从而参与各种生理病理过程，这条信号传导通路被称为NO-cGMP信号通路。该通路参与视锥细胞的递质释放，水平细胞的网络调控，双极细胞谷氨酸受体介导的信号传导，调控双极细胞和视杆无长突细胞间的信号交互，控制神经节细胞和Muller细胞的离子通道活性，此外NO还有参与炎症反应，抑制细胞增殖等多种作用。目前NO信号通路在近视方面的研究刚刚起步并且相关研究的结果主要来自于药物干预，与生理状态下的表现有差异，并且这些药物干预的结论问并不统一。近视发展过程中N0信号通路怎样变化，和近视发展的关系如何，与M受体拮抗剂有无关系是本研究所关心的问题。
本研究首先通过建立豚鼠形觉剥夺性近视模型，研究不同诱导时期豚鼠视网膜、脉络膜和巩膜中一氧化氮合成酶(NOS)活性及cGMF含量改变，用免疫组化检测豚鼠眼组织中NOS分布；其次用MK-801抑制眼组织NOS活性观察其对形觉剥夺性近视发展的影响，明确NO信号通路与近视的关系，用视网膜电图和组织凋亡检测观察药物注射后对视网膜功能和结构的影响；最后在人巩膜成纤维细胞中探讨哌伦西平与NO信号通路间的关系。
材料与方法：
1.实验材料：
1.1.实验动物实验动物为两周龄体重130-150g的幼年豚鼠。在形觉剥夺性近视NOS活性和cGMP含量测定实验中，随机分为正常对照组(27只)和形觉剥夺性近视组(54只)，以建立近视模型后7天、14天、21天为观察点，每一时间点处死正常对照组9只豚鼠和形觉剥夺性近视组18只豚鼠进行生化检测。在MK-801干预实验中随机分为6组，每组6只动物，分为形觉剥夺+盐水注射组和形觉剥夺+不同剂量MK-801注射组，每R进行玻璃体腔注射，处理2周后观察指标变化。
1.2.实验试剂与器材(略)。
2.实验方法：
2.1.豚鼠形觉剥夺性近视模型的建立及指标检测用半透明镜片诱导豚鼠形觉剥夺性近视，诱导组豚鼠随机遮盖一眼，正常对照组为同窝正常双眼开放豚鼠。诱导前及不同诱导期结束时对诱导眼，诱导对侧眼，正常对照双眼用带状检影镜进行盲法验光并用自动高频A超仪测量眼轴长度。
2.2.豚鼠眼组织NOS活性检测制备正常组和形觉剥夺组眼组织匀浆液，加入10uCi<3>H-精氨酸，用液闪仪检测单位时间内<3>H-精氨酸被催化形成产物<3>H-胍氨酸的放射量，除以组织匀浆液的蛋白含量进行比较。
2.3.豚鼠眼组织cGMP含量检测采用竞争性结合原理进行检测，给予定量125>I-cGMP和cGMP抗血清，同时加入一定量组织提取液(含cGMP)，竞争性结合后用Y计数器检测沉淀中的放射量，通过标准曲线求出各组眼组织中cGMP含量
2.4.豚鼠眼组织一氧化氮合酶亚型分布的免疫组化测定制备正常豚鼠眼组织冰冻切片，加入神经元型NOS、诱导型NOS、内皮型NOS三种NOS亚型抗体，用DAB显色，检测其表达及部位。
2.5.MK-80 1玻璃体腔注射抑制一氧化氮合酶活性选2周大体重130-150g的豚鼠，单眼形觉剥夺并在形觉剥夺眼给予玻璃体腔内注射7ul生理盐水或MK-801，MK-801的剂量为0.08ug/ul，0.4ug/ul，2ug/ul，10ug/ul，20ug/ul，注射频率为1次/天，其中10ug/ul和20ug/ul的注射频率为2天1次，共注射2周。注药前及2周注药末测量屈光度及眼轴改变。
2.6.豚鼠视网膜电图检测检测白光暗视视网膜电图，记录各处理组豚鼠视网膜电图a、b波振幅和潜伏期，ops2波振幅和潜伏期。以处理前后的差值进行统计分析。
2.7.眼组织细胞凋亡检测采用TUNEL法检测豚鼠药物注射组眼后极部组织中是否有凋亡产生的DNA断裂片段。
2.8.眼内注药组组织NOS活性测定NOS催化L-精氨酸和分子氧反应生成NO，NO与亲核性物质生成有色化合物，在530nm波长测定吸光度，根据吸光度大小计算盐水组和MK-801组眼组织NOS活性。
2.9.人巩膜成纤维细胞原代培养、鉴定自眼库取4个月大婴儿眼球，无菌化处理，分离巩膜剪成1×1mm大小组织块，用组织块贴壁法进行培养。细胞长出后用传二代细胞进行鉴定，免疫荧光检测其角蛋白，平滑肌肌动蛋白，S-100和波形蛋白的表达。
2.10.人巩膜成纤维细胞NOS亚型的表达制备细胞爬片，用免疫组化DAB显色观察细胞中各NOS亚型的表达。
2.11.MTT法测定细胞生长曲线及药物对细胞生长的影响用MTT法制作不同细胞浓度的生长曲线，选取合适的细胞浓度进行药物干预，观察哌伦西平和NO供体硝普纳对巩膜细胞增殖的影响 。
2.12.哌伦西平对人巩膜成纤维细胞NO-cGMP信号通路的作用按同一细胞密度接种，药物处理5天后用比色法检测细胞悬液中NOS活性，用放射免疫法检测培养液及细胞悬液中cGMP含量。
2.13.统计学分析测定结果以均数±均数标准差表示。两组间比较用独立样本t检验，多组间比较用方差分析。统计软件采用SPSS 12.0 for Windows.
结论：
1.形觉剥夺性近视中视网膜、脉络膜和巩膜NO信号通路先抑制后升高且后期信号通路的上调与负反馈调节有关。
2.形觉剥夺性近视中NO通路可能参与抑制近视发展的信号通路。
3.哌伦西平可能通过NO信号通路对人巩膜成纤维细胞产生抑制作用。
4.豚鼠视网膜、脉络膜和巩膜组织及人巩膜成纤维细胞中三种NOS亚型均有表达