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本论文以一株能在胞外积累大量-酮戊二酸和丙酮酸的解脂亚洛酵母(Yarrowialipolytica)硫胺素营养缺陷型菌株CCTCC M207143为出发菌株，以与丙酮酸代谢密切相关的乙酰辅酶A代谢途径和丙酮酸羧化途径为研究对象，结合代谢工程和发酵工程手段，强化丙酮酸进入三羧酸循环(TCA循环)的代谢通量，实现丙酮酸向-酮戊二酸的有效转化。在促进-酮戊二酸过量合成的同时减少副产物—丙酮酸的积累，提高发酵液中-酮戊二酸对丙酮酸的浓度比。本论文主要结论如下：(1)通过酶切连接技术，将潮霉素磷酸转移酶基因(hph)替换现有质粒p0上的尿嘧啶标记基因(URA3)，构建重组质粒p0(hph)。重组质粒p0(hph)中hph基因赋予p0(hph)质粒对潮霉素B的抗性，可作为后续重组菌筛选的标记基因。将p0(hph)转化Y. lipolyticaWSH-Z06感受态细胞，在200g/mL的潮霉素B平板上筛选重组菌Y. lipolytica-CON，作为后续试验的对照菌。(2)调控乙酰辅酶A代谢促进-酮戊二酸的生成。(1)选取来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2)的乙酰辅酶A合成酶基因(ACS1)，构建整合型表达载体p0(hph)-ACS1，将p0(hph)-ACS1转化Y. lipolytica WSH-Z06感受态细胞，经筛选得到一株过量表达S. cerevisiae乙酰辅酶A合成酶的重组菌Y. lipolytica-ACS1。重组菌胞内乙酰辅酶A合成酶的比酶活可达0.92U/mg protein，比对照菌提高10.5倍，胞内乙酰辅酶A含量达到4.97nmol/mg DCW，比对照菌提高131.2%。摇瓶发酵结果表明，过量表达ACS1基因使重组菌中-酮戊二酸产量达到42.2g/L，比对照菌(36.3g/L)提高16.2%；同时丙酮酸产量为14.5g/L，比对照菌降低31.6%。(2)选取来自小鼠(Mus musculus)的ATP-柠檬酸裂解酶基因(ACL)，构建整合型表达载体p0(hph)-ACL，将p0(hph)-ACL转化Y. lipolytica WSH-Z06感受态细胞，经筛选得到一株过量表达M. musculusATP-柠檬酸裂解酶的重组菌Y. lipolytica-ACL。重组菌胞内ATP-柠檬酸裂解酶的比酶活可达1.51U/mg protein，比对照菌提高11.6倍，胞内乙酰辅酶A含量达到5.25nmol/mg DCW，比对照菌提高144.2%。摇瓶发酵结果表明，过量表达ACL基因使重组菌中-酮戊二酸产量达到46.7g/L，比对照菌(36.3g/L)提高28.6%；同时丙酮酸产量为10.6g/L，比对照菌降低50%。以上结果表明，提高胞内乙酰辅酶A供给能够有效促进丙酮酸的进一步代谢并促进-酮戊二酸的过量积累。(3)强化丙酮酸羧化途径促进-酮戊二酸的生成。(1)选取来自S. cerevisiaeCEN.PK2的丙酮酸羧化酶基因(ScPYC1)，构建整合型表达载体p0(hph)-ScPYC1，将p0(hph)-ScPYC1转化Y. lipolytica WSH-Z06感受态细胞，筛选得到一株过量表达S.cerevisiae丙酮酸羧化酶的重组菌Y. lipolytica-ScPYC1。重组菌胞内丙酮酸羧化酶的比酶活可达0.59U/mg protein，比对照菌提高6.5倍。摇瓶发酵结果表明，过量表达ScPYC1基因使重组菌中-酮戊二酸产量达到45.2g/L，比对照菌(36.3g/L)提高24.5%；同时丙酮酸产量为10.2g/L，比对照菌降低51.9%。(2)选取来自米根霉(Rhizopus oryzae)的丙酮酸羧化酶基因(RoPYC2)，构建整合型表达载体p0(hph)-RoPYC2，将p0(hph)-RoPYC2转化Y. lipolytica WSH-Z06感受态细胞，筛选得到一株过量表达R. oryzae丙酮酸羧化酶的重组菌Y. lipolytica-RoPYC2。重组菌胞内丙酮酸羧化酶的比酶活可达0.87U/mgprotein，比对照菌提高10.2倍。摇瓶发酵结果表明，过量表达RoPYC2基因使-酮戊二酸产量达到49.1g/L，比对照菌(36.3g/L)提高35.3%；同时丙酮酸产量为6.4g/L，比对照菌降低69.8%。(3)利用定量PCR和酶活测定技术，研究过量表达丙酮酸羧化酶前后与-酮戊二酸和丙酮酸代谢相关途径的变化情况。综合分析重组菌中关键基因的转录和关键酶活性的变化，可知强化丙酮酸羧化途径能够有效促进碳代谢流经丙酮酸羧化途径进入TCA循环并强化异柠檬酸向-酮戊二酸的转化，从而提高-酮戊二酸的产量。(4)重组菌的发酵优化与控制。研究乙酸钠对Y. lipolytica-ACS1产酸的影响、柠檬酸三钠对Y. lipolytica-ACL产酸的影响以及生物素对Y. lipolytica-ScPYC1和Y.lipolytica-RoPYC2产酸的影响。结果表明，乙酸钠的最佳添加量为6g/L，此时Y.lipolytica-ACS1中-酮戊二酸产量达到49.2g/L，比对照(42.2g/L)提高16.6%，丙酮酸产量为17.5g/L，比对照提高20.7%。柠檬酸三钠的最佳添加量是4g/L，此时Y.lipolytica-ACL中-酮戊二酸产量达到53.1g/L，比对照(46.7g/L)提高13.7%，丙酮酸产量为7.4g/L，比对照降低30.2%。在Y. lipolytica-ScPYC1中，生物素的最佳添加量是0.6mg/L，此时-酮戊二酸产量达到51.2g/L，比对照(45.2g/L)提高13.3%，丙酮酸产量为7.2g/L，比对照降低29.4%。在Y. lipolytica-RoPYC2中，生物素的最佳添加量是1.0mg/L，此时-酮戊二酸产量达到55.6g/L，比对照(49.1g/L)提高13.2%，丙酮酸产量为4.6g/L，比对照降低28.1%。在3-L发酵罐上采取pH两阶段控制策略，-酮戊二酸的最大产量可达62.5g/L，比对照提高47.4%，丙酮酸产量仅为13.5g/L，比对照降低61.5%，C-酮戊二酸/C丙酮酸比对照提高282.6%。以上结果表明，通过适当的发酵优化和控制，重组菌中-酮戊二酸产量得到显著提高。