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黑暗链霉菌Tt-49主要产安普霉素、妥布霉素和氨甲酰妥布霉素等氨基糖苷类抗生素。采用基因敲除技术,获得单组分氨甲酰妥布霉素工程菌和安普霉素工程菌。在此基础上,插入来自小单孢菌中C3’,4’-双脱羟基酶基因或甲基化酶基因,探索其与黑暗链霉菌生物合成基因组合的可能性。具体内容如下:1.氨甲酰妥布霉素工程菌的构建。在穿梭载体pKC 1139的基础上构建重组质粒pKB5,经接合转移导入黑暗链霉菌Tt-49,得到单交换菌株ST315。经松弛培养后,利用影印筛选和PCR扩增鉴定,获得aprK基因缺失突变株ST316。ST316发酵产物经TLC和MS分析,结果表明ST316不再合成安普霉素,主要积累氨甲酰妥布霉素,可作为基因组合模式菌。2.安普霉素工程菌的构建。使用同样的出发菌株:黑暗链霉菌Tt-49,按照敲除aprK相似的研究方法,构建了tobM 基因缺失突变株TW402。TW402菌株发酵产物经TLC分析和MS检测,表明TW402不再合成氨甲酰妥布霉素,主要积累安普霉素。3.小单孢菌3’,4’-双脱羟基酶基因与黑暗链霉菌安普霉素生物合成基因组合的研究:以aprD4作为3’,4’-双脱羟基酶基因组合位点,分别将依纽小单孢菌生物合成基因sisI和绛红色小单孢菌生物合成基因genP替换黑暗链霉菌ST316生物合成基因aprD4,得到sisI基因替换aprD4的工程菌TW414和genP基因替换aprD4的工程菌TW416。对TW414和TW416分别进行发酵及代谢产物分析,结果表明TW414和TW416都不再产氨甲酰妥布霉素,主产氨甲酰卡那霉素B和卡那霉素B,并没有得到地贝卡星等其它物质。4.小单孢菌甲基化基因与黑暗链霉菌妥布霉素生物合成基因组合研究:以tobM2作为甲基化酶基因组合位点,构建forK基因替换tobM2的同源重组质粒pKM5,经接合转移导入Tt-49,获得forK与妥布霉素生物合成基因组合工程菌TW420。对TW420的发酵产物进行MS检测,发现其与菌株TW402结果类似,不再产氨甲酰妥布霉素,主产安普霉素。5.基因genB4功能研究的意外收获。在构思小单孢菌特色功能基因genB4与黑暗链霉菌生物合成基因组合的准备过程中,为阐明genB4基因功能,通过敲除genB4基因,意外获得主产西索霉素的绛红色小单孢菌GbKB4。因此,从基因组合转向该工程菌生产力特性的研究上。以菌株GbKB4为出发菌株,经过自然分离纯化和紫外诱变获得发酵单位比出发菌高3倍的GbKB4-2菌株。对GbKB4-2菌株进行遗传稳定性和发酵特性考察,绘制西索霉素发酵代谢曲线图,最终发酵单位高达970u/mL,具有极好的产业化应用前景。基因组合留待后续继续深入研究。通过基因替换,将小单孢菌生物合成基因与黑暗链霉菌生物合成基因进行组合研究,并未得到我们预期出现的新组分,推测小单孢菌中的3’,4’-双脱羟基酶与甲基化酶基因并不是单独起作用,需借助自身环境影响,小单孢菌的与黑暗链霉菌的生物合成酶系差异较大,所以小单孢菌基因未能正常表达。