第一部分 手术诱导骨髓未成熟细胞来源外泌体促肿瘤生长转移的机制研究[目的]手术可引起机体重大的代谢、炎症和免疫应激等变化。骨髓未成熟细胞(Immature myleiod cells,IMC)是骨髓来源的一群异质性细胞群体,通常在炎症或癌症中大量增殖。外泌体(Exosome)在肿瘤的发生、发展等多个环节发挥重要作用。但是手术诱导骨髓来源Ly6G+IMC及其分泌外泌体对肿瘤进程的影响尚不清楚。我们通过体内、体外实验来研究手术诱导骨髓来源Ly6G+IMC和肿瘤生长转移的关系,进一步分离Ly6G+IMC来源外泌体,体内、体外实验探讨Ly6G+IMC来源外泌体对肿瘤生长转移的影响。[研究方法]1、荷瘤小鼠术后转移模型构建:小鼠Lewis肺癌细胞(Lewis lung Carcinoma,LLC)(l×l06)接种至C57BL/6雌小鼠背部正中,待肿块体积长至1200 mm3后切除背部肿块,缝合切口。继续饲养,在术后第23天处死小鼠,观察体内转移情况。2、手术诱导骨髓来源未成熟细胞对肿瘤生长的影响:LLC细胞(l×106)接种至C57BL/6雌性小鼠背部正中,待肿块体积长至1200 mm3后切除荷瘤鼠背部肿块,流式细胞术检测荷瘤小鼠骨髓Ly6G+IMC手术第0H、24H、48 H、72 H、Day5和Day7的变化趋势;根据流式结果选择术后一个时间点,免疫磁珠分选技术分选荷瘤小鼠手术后和未手术骨髓来源Ly6G+IMC,LLC细胞(5×104)接于24孔板待细胞贴壁后分为五组:加入荷瘤小鼠手术后骨髓来源Ly6G+IMC(LLC+TF6G);加入未手术荷瘤小鼠骨髓来源Ly6G+IMC(LLC+TB6G);放入细胞小室,并在上室面加入荷瘤小鼠手术后骨髓来源Ly6G+IMC(LLC+Transwell+TF6G);放入细胞小室,并在上室面加入荷瘤小鼠手术后骨髓来源 Ly6G+IMC 和 GW4869(10 μmol/L)(LLC+Transwell+TF6G+GW4869);加入PBS(LLC)。利用CCK-8细胞增殖实验测定LLC细胞的吸光度值。LLC细胞(l×106)接种于C57BL/6雌小鼠背部正中,接种后的第三天开始尾静脉注射,分为三组:尾静脉注射荷瘤小鼠手术后骨髓来源Ly6G+IMC(TF6G组);尾静脉注射荷瘤小鼠手术后骨髓来源Ly6G+IMC同时进行腹腔注射GW4869(1.25 mg/kg)(TF6G+GW4869 组);尾静脉注射 PBS(PBS 组)。分别在尾静脉注射的第7、10和14天测量荷瘤鼠背部肿块体积。3、手术诱导骨髓未成熟细胞来源外泌体对肿瘤生长转移的影响:LLC细胞(l×106)接种于C57BL/6雌小鼠背部正中,待肿块长至1200 mm3后分为两组:手术组切除肿瘤;未手术组不做处理。术后48 H分别处死两组小鼠,无菌条件下用DMEM冲出骨髓进行免疫磁珠分选,获得四组细胞:荷瘤小鼠手术后骨髓来源Ly6G+IMC、荷瘤小鼠手术后骨髓来源Ly6C+IMC、未手组荷瘤小鼠骨髓来源Ly6G+MC和未手组荷瘤小鼠骨髓来源Ly6C+IMC。四组细胞分别在体外培养72 H后收集上清,Qiagen外泌体提取试剂盒提取四组细胞来源外泌体。LLC细胞接于细胞培养板,待细胞贴壁后分为五组:加入荷瘤小鼠手术后骨髓来源Ly6G+IMC外泌体(TF6G组),加入未手术荷瘤小鼠骨髓来源Ly6G+IMC外泌体(TB6G组),加入荷瘤小鼠手术后骨髓来源Ly6C+IMC外泌体(TF6C组),加入未手术荷瘤小鼠骨髓来源Ly6C+IMC外泌体(TB6C组),加入PBS(PBS组)。分别利用PI单染色法检测LLC细胞周期进展、CCK-8细胞增殖实验检测LLC细胞吸光度值和Transwell细胞侵袭实验检测LLC细胞侵袭数量。LLC细胞(1×106)接种于C57BL/6雌小鼠背部正中,接种第三天开始尾静脉注射外泌体分为五组:尾静脉注射荷瘤小鼠手术后骨髓来源Ly6G+IMC外泌体(TF6G组);尾静脉注射未手术荷瘤小鼠Ly6G+IMC外泌体(TB6G组),尾静脉注射荷瘤小鼠手术后骨髓来源Ly6C+IMC外泌体(TF6C组),尾静脉注射未手术荷瘤小鼠骨髓来源Ly6C+IMC外泌体(TB6C组),尾静脉注射PBS(PBS组)。分别在尾静脉注射的第6、12和18天测量荷瘤鼠背部肿块体积。[结果]荷瘤鼠术后转移模型构建:C57BL/6雌小鼠背部接种LLC细胞两周左右,背部形成1200 mm3的肿块。切除背部肿块,在术后的第23天,肝脏、肺脏以及肾脏均形成了肉眼可观的转移灶。手术诱导骨髓来源Ly6G+IMC对肿瘤生长的影响:流式细胞术结果显示,荷瘤小鼠术后骨髓中Ly6G+IMC逐渐增多,且在术后48 H(67.83±7.46)%达到峰值,48H以后呈现下降趋势。根据流式细胞术结果,选择术后第48 H分别对荷瘤小鼠手术后和未手术骨髓中Ly6G+IMC进行分选。CCK-8细胞增殖实验结果显示:LLC+TF6G组LLC细胞吸光度值显著高于LLC+TB6G组和LLC组(24 H:F=6.122,P=0.036;48 H:F=232.418,P=0.000;72 H:F=267.148,P=0.000),LLC+Transwell+TF6G+GW4869 组 LLC 细胞吸光度值显著低于LLC+Transwell+TF6G 组(24 H:t=8.215,P=0.001;48 H:t=33.549,P=0.000;72 H:t=40.379,PP=0.000)。体内尾静脉注射Ly6G+IMC实验结果显示:尾静脉注射的第7天,TF6G组荷瘤鼠背部皮下肿块体积显著大于TF6G+GW4869组(F=7.569,P=0.012),第10和14天时,TF6G组荷瘤鼠背部皮下肿块体积显著大于 TF6G+GW4869 组和 PBS 组(F=12.89,P=0.002;F=6.743,P=0.016)。手术诱导骨髓Ly6G+IMC来源外泌体对肿瘤生长转移的影响:PI单染色法检测LLC细胞周期结果显示:TF6G组LLC细胞第48 H G2/M期细胞百分比显著高于 TB6G 组、TF6C 组、TB6C 组和 Negative 组(F=40.398,P=0.000)。CCK-8检测LLC细胞吸光度值结果显示:第24 H时TF6G组LLC细吸光度值显著高于 TB6G 组(F=29.65,P==0.000),第 48 H 和 72 H 时,TF6G 组 LLC 细吸光度值显著高于 Negative 组、TB6G 组、TF6C 组和 TB6C 组(F=43.919,P==0.000;F=705.777,P=0.000)。Transwell细胞侵袭实验检测LLC细胞侵袭数量结果显示:TF6G组LLC细胞侵袭数量显著多于Negative组、TB6G组、TF6C组和TB6C组(F=8.045,P=0.004)。尾静脉注射外泌体结果显示:尾静脉注射的第12天,TF6G组荷瘤鼠背部皮下肿块体积值著大于TB6G组、TF6C组和TB6C组(F=6.455,P=0.002),尾静脉注射的第18天,TF6G组荷瘤鼠背部皮下肿块体积值著大于 PBS 组、TB6G 组、TF6C 组和 TB6C 组(F=16.388,P=0.000)。[结论]1.手术可能促进肿瘤发生转移。2.手术会引起荷瘤鼠骨髓Ly6G+IMC应激性地增加。3.手术诱导骨髓来源Ly6G+IMC能促肿瘤增殖。4.手术诱导骨髓来源Ly6G+IMC不依赖于细胞-细胞直接接触发挥促肿瘤细胞增殖作用。5.手术诱导骨髓来源Ly6G+IMC外泌体能促肿瘤细胞周期进程。6.手术诱导骨髓来源Ly6G+IMC外泌体能促肿瘤细胞增殖。7.手术诱导骨髓来源Ly6G+IMC外泌体能促肿瘤细胞侵袭。8.手术诱导骨髓来源Ly6G+IMC外泌体能在体内促肿瘤生长。第二部分 手术诱导骨髓未成熟细胞来源外泌体非编码RNA和肿瘤增殖转移的关系研究[目的]非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)是一类不能翻译成蛋白质的RNA,ncRNA可导致癌症在内的多种疾病。外泌体来源ncRNA在肿瘤进程中发挥重要作用。手术诱导骨髓Ly6G+IMC外泌体来源ncRNA在肿瘤生长转移中所发挥的作用机制尚不清楚。本研究通过荷瘤小鼠手术后和未手术骨髓来源IMC外泌体ncRNA进行测序分析,通过生物学信息对数据进行分析,筛选荷瘤小鼠手术后和未手术骨髓来源IMC外泌体差异表达ncRNA,并对其进行验证,进一步探讨荷瘤小鼠手术后和未手术骨髓来源IMC外泌体差异表达ncRNA在肿瘤生长转移中发挥的作用机制。[方法]LLC细胞(1×106)接种于C57BL/6雌小鼠背部正中,待肿块长至1200 mm3后分为两组:手术组切除肿瘤;未手术组不做处理。术后48 H分别处死两组小鼠,无菌条件下用DMEM冲出骨髓进行免疫磁珠分选,获得四组细胞:荷瘤小鼠手术后骨髓来源Ly6G+IMC、荷瘤小鼠手术后骨髓来源Ly6C+IMC、未手术荷瘤小鼠骨髓来源Ly6G+IMC和未手术荷瘤小鼠骨髓来源Ly6C+IMC。四组细胞分别体外培养72 H后收集上清,Qiagen外泌体提取试剂盒提取四组细胞来源外泌体。ExoRNeasy Serum/Plasma(Qiagen)提取四组细胞来源外泌体RNA。将四组IMC来源外泌体非编码RNA进行测序分析,分别将荷瘤小鼠手术后和未手术荷瘤小鼠骨髓来源Ly6G+IMC外泌体、荷瘤小鼠手术后和未手术荷瘤小鼠骨髓来源Ly6C+IMC外泌体非编码RNA中的环状RNA(circular RNA,circRNA)进行生物信息学分析,结合第一部分实验结果针对性地筛选荷瘤小鼠手术后和未手术荷瘤小鼠骨髓来源Ly6G+IMC外泌体中差异表达的circRNA,根据筛选结果设计差异circRNA引物,利用qRT-PCR进行差异验证。[结果]荷瘤小鼠手术后和未手术荷瘤小鼠骨髓来源Ly6G+IMC外泌体差异表达319个circRNA,荷瘤小鼠手术后和未手术荷瘤小鼠骨髓来源Ly6C+IMC外泌体差异表达82个circRNA。将荷瘤小鼠手术后和未手术荷瘤小鼠骨髓来源Ly6G+IMC外泌体差异表达的circRNA筛选出18个具代表性的circRNA,设计引物利用qRT-PCR进行差异验证。[结论]荷瘤小鼠手术后和未手术荷瘤小鼠骨髓来源Ly6G+IMC外泌体中差异表达的circRNA数量最多,且前期工作实验结果证明手术诱导骨髓Ly6G+IMC来源外泌体能促肿瘤增殖和侵袭,说明在荷瘤小鼠手术后和未手术荷瘤小鼠骨髓来源Ly6G+IMC外泌体差异表达的circRNA中存在着和肿瘤增殖或转移相关的circRNA。