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体细胞克隆猪在动物繁育、遗传资源保护以及医学动物模型等方面都有重要的应用价值。然而克隆胚胎在植入前的丢失率超过80%,克隆猪的出生效率只有1%左右。这严重限制了猪克隆技术的应用。小鼠作为模式生物,对其研究更加深入,提高小鼠克隆效率的方法往往在其他动物克隆中被借鉴。过表达小鼠组蛋白去甲基化酶,可以擦除H3K9me3基因修饰,大幅提高克隆胚胎的发育效率（8%vs 1%）。但其克隆效率和体内出生效率相比仍有较大差距（50%）,这说明还有很多影响克隆胚胎发育效率的机制未被发现。同时,小鼠中提高克隆效率的有效方法在其他动物中不完全适用,这也说明导致克隆效率低有共性原因,也有品种间的特异性。本文拟探索猪克隆胚胎发育异常的分子机制,为研究动物胚胎发育调控机理,提高克隆猪出生效率提供理论依据。项目通过克隆猪KDM4家族基因并构建过表达载体,研究KDM4家族成员对H3K9me3修饰的调控和对猪克隆效率的影响;通过单细胞转录组技术对克隆胚胎、体内同期胚胎研究,利用ATAC-seq技术对供体体细胞进行分析,揭示猪克隆胚胎2细胞和4细胞时期胚胎发育失败的原因;利用基因靶向或者小分子对胚胎异常发育进行调控。主要研究结果如下:（1）成功克隆猪KDM4A、KDM4B、KDM4C和KDM4D基因的编码区,分别为3201、3249、3165和2766 bp。成功构建KDM4A、KDM4B、KDM4C和KDM4D基因的真核表达载体,并且能在细胞和胚胎水平显著下调H3K9me3的水平（P＜0.05）。KDM4家族基因的表达量与胚胎发育关系无直接关联。猪KDM4家族基因并不能大幅度的提高猪克隆胚胎的发育效率,可能是由于H3K9me3修饰在猪克隆胚胎中处于低水平,不是发育异常和失败的主要原因。（2）猪成体成纤维细胞的总计检测到25274基因的表达（FPKM＞0）,占注释基因的65.96%。对10873个表达基因（FPKM＞1）的基因进行功能注释,主要涵盖细胞的周期、基因表达调控、RNA和蛋白组的合成与降解、能量的代谢、细胞的衰老凋亡与自噬。猪成体成纤维细胞的ATAC-seq,总计检测到了20323个peaks,其中67.51%peaks在基因附近。peaks涉及的6620个基因主要富集到细胞周期、大分子的合成与代谢、转录的调控、物质的转运等。猪成体成纤维细胞的基因表达量和转录起始位点和基因区域的染色质开放程度成正相关关系。（3）体内来源胚胎2细胞、4细胞和8细胞时期通过DEseq2的方法分析得到激活基因数目分别是1461、3316和4348。猪体内胚胎在2细胞时期基因组小范围激活,主要合子基因激活时期为4-8细胞时期。2细胞时期激活的基因主要富集到c GMPPKG、TGF-beta和Hippo等转录信号通路,4细胞时期就的基因主要富集到RNA的转录合成与成熟以及营养物质的吸收与代谢,8细胞时期的基因主要富集到蛋白的合成以及ATP的合成。体内来源和体外来源的卵母细胞分析总计发现1045个差异基因,相对于体内来源卵母细胞,体外来源卵母细胞中有609个基因发生上调,436个下调。差异基因主要富集到线粒体组成、氧化磷酸化、RNA剪接、RNA降解等通路。利用DEseq2方法对2细胞时期克隆胚胎分析发现。2细胞停滞胚胎NT211相较于NT222和NT22b胚胎都表现出严重的基因激活不足。NT211和NT222的差异基因为4996个,其中1641个上调,3355个下调;NT211和NT22b差异基因为3073,其中917个上调,2156个下调。差异基因被富集到氧化磷酸化、RNA剪接、核糖体合成等。ATAC-seq数据显示,停滞胚胎未激活基因在体细胞中的染色质状态相对开放,暗示NT211胚胎基因未激活原因可能是激活性修饰不足。4细胞停滞胚胎NT243相较于NT24b胚胎,存在在研究的基因激活不足。差异基因为5614个,其中上调基因为1812,下调基因基因为3802。这些基因主要富集在蛋白的合成与转运、物质及能量代谢合成上。ATAC-seq数据显示,停滞胚胎未激活基因在体细胞中的染色质状态相对开放,暗示NT243胚胎基因未激活原因可能是激活性修饰不足。通过WGCNA方法分析2细胞时期克隆胚胎发现,HDAC2和SIRT1基因所在模块和2细胞停滞胚胎NT211显著的正相关。HDAC2和SIRT1具备擦除激活性修饰组蛋白乙酰化的能力,是潜在导致NT211胚胎基因不能激活的关键基因。（4）利用siRNA下调猪克隆胚胎中HDAC2基因表达和利用CAY10683抑制HDAC2基因均可以显著的提高克隆胚胎的发育效率。利用si RNA下调猪克隆胚胎中SIRT1基因表达和利用EX527抑制SIRT1基因均可以显著的提高克隆胚胎的发育效率。利用HDAC2和SIRT1基因的si RNA同时注射干扰和用CAY10683和EX527进行联合孵育猪克隆重构胚胎均没有对发育效率促进作用的叠加效应。克隆胚胎发育效率的提高可能是由于组蛋白乙酰化水平的提高和DNA甲基化水平的下调而引起的基因组激活水平提高。克隆效率的提高是广泛利用克隆技术的前提。本研究首先验证了KDM4家族并能大幅度的提高猪的克隆效率,说明了克隆异常机制在物种间的异质性;利用胚胎活检结合测序技术,成功为异常克隆胚胎建立了2细胞时期和4细胞时期的正常体内胚胎和克隆正常发育胚胎两个参照,鉴定和验证了HDAC2和SIRT1可能是影响猪克隆早期胚胎发育的关键基因,最终利用si RNA干扰和小分子抑制的方法成功的提高了克隆胚胎的早期发育性能,为进一步提高猪的克隆效率打下了坚实的基础。