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本研究以NtCPK5cDNA序列为信息探针,通过电子克隆的方法,获得了一个长1982bp的钙依赖蛋白激酶基因LeCPK2,对.LeCPK2及其编码的蛋白结构以及该基因的表达等特性做了分析,并对其功能进行了初步的研究,获得如下结果:
1.序列分析表明,该基因包含完整的阅读框,编码565个氨基酸,推导的蛋白分子量为66.8KDa。该蛋白具有典型钙依赖型蛋白激酶的结构特征,即激酶区、自抑制区和4个EF手型结构。该氨基酸序列与StCPKI、NtCPK5及NtCPK4具有很高的同源性,分别为95%、90%和88%。进化树分析表明LeCPK2在进化上处于CPK和CRK之间。
2.半定量RT-PCR结果显示:LeCPK2在根、茎、叶、花、果中均有表达,但具有组织差异性,LeCPK2在花中大量表达,叶和根次之,在茎和果中微量表达;42℃高温能够诱导LeCPK2基因的表达,而4℃低温对LeCPK2的表达几乎没有影响;机械伤害后叶片中LeCPK2表达量显著增加;LeCPK2能对乙烯、茉莉酸和水杨酸刺激做出不同程度的响应。
4.为了进一步了解该蛋白激酶的生化特性,构建了原核表达载体pET30a-LeCPK2,在大肠杆菌中表达获得了特异的表达蛋白,并对蛋白进行了纯化获得了有活性的蛋白激酶。
5.构建了中间载体pART7-LeCPK2和表达载体pART27-LeCPK2,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,经PCR检测共获得了32棵阳性植株。
6.初步分析表明,LeCPK2蛋白参与了乙烯、茉莉酸和水杨酸调节的信号途径,并能对高温和伤害做出响应,因此,LeCPK2在番茄的生长发育过程中可能参与多种具有调节途径。