前言肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)最早是从部分肝切除的大鼠血清中分离得到的,是一种很强的刺激肝细胞增殖的分裂原。成熟的HGF分子由α链(69kD)和β链(34kD)通过二硫键连接组成异二聚体。α链有4个Kringle区,其N端有一个发夹样结构,α链N端的发夹样结构与前两个Kringle区结构为HGF发挥生物学效应所必需;β链具有丝氨酸蛋白酶样结构,但由于其激活部位的两个氨基酸发生了替换,所以没有蛋白酶的催化活性。HGF主要通过细胞膜上的特异性受体c-Met发挥其生物学效应。HGF-c-Met信号传导通路广泛存在于各种细胞中,对多种组织器官的生长发育具有重要的生理调节功能。但当细胞过表达HGF或c-Met时,常常导致细胞发生癌变,而且对多种肿瘤细胞的生长、侵袭和转移能力等具有重要作用。1997年Date等通过对重组人HGF进行消化裂解发现了一种新的HGF拮抗剂,它由HGFα链N末端的447个氨基酸和4个Kringle区域所组成,故命名为NK4,分子量为50kD。其结构与血管抑制剂——血管抑素具有显著的相似性。NK4可以与c-Met结合,竞争性地完全抑制HGF和c-Met的相互作用,影响HGF/c-Met系统的信号转导,从而抑制HGF所诱导的细胞的增殖、运动和形态形成等,但其本身不能诱导c-Met的酪氨酸磷酸化。体外研究证实N K4可抑制HGF诱导包括人的胆囊癌、胆管癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等细胞的运动和侵袭。宫颈癌是妇科三大恶性肿瘤之一,严重威胁着妇女的健康与生命。随着社会的发展,一些肿瘤的流行病学因素也在不断地发生变化,如伴随人乳头瘤病毒感染的蔓延和播散,宫颈癌的发病年龄已经出现明显的年轻化趋势,因此,对妇科恶性肿瘤的治疗显得由为重要。新近的研究证实,NK4阻断HGF-c-Met途径和肿瘤血管形成的双重作用可成为抗肿瘤治疗的策略之一。在对肿瘤组织进行病理学分析时发现,N K4可显著抑制肿瘤组织中微血管的形成,抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞的凋亡。最近Saga等将含有N K4基因的表达质粒导入卵巢癌细胞系HRA中,结果发现N K4可显著抑制HRA细胞的迁移;明显抑制小鼠肿瘤的生长和腹水的形成,延长小鼠的生存期。因此,N K4不仅是HGF的拮抗剂,同时也是微血管形成的抑制剂。N K4在抗肿瘤的生长和侵袭转移治疗中可能具有重要作用,但有关其在妇科肿瘤中如子宫颈癌中的作用目前国外少见相关研究报道,国内未见报道。为此本课题的提出,旨在通过构建pBudCE4.1-EGFP/NK4真核细胞表达载体并进行子宫颈癌细胞系转染表达研究,及其对生长及转移的影响。为下一步建立动物移植瘤模型探讨NK4在动物体内的抗肿瘤作用提供依据。使N K4的基因转导成为肿瘤治疗的一条有效的新途径,从而进一步提高肿瘤综合治疗的临床疗效。实验材料和方法一、实验材料试剂RNA抽提试剂盒,RT-PCR试剂盒,琼脂糖凝胶回收试剂盒,限制性内切酶KpnⅠ,BglⅡ,Xbal-Ⅰ和HindⅢ,T4 DNA连接酶均购自Takara公司,感受态细胞Machl-T1,克隆载体pEasy-Blunt Simple载体购自北京全式金公司,pEGFP-N1质粒,pBudCE4.1载体,大肠杆菌DH5α,质粒抽提试剂盒,TaqDNA聚合酶Lipofectamine2000为广州泰康生物公司提供。Annexin V-FITC/PI双染试剂盒(B620033,BIPEC BIOPHARMA,U.S.A)。基因测序由上海英骏公司完成。二、主要研究方法从人胎肝中抽提出总RNA,并以此为模板,利用人工合成的一对引物,采用RT-PCR技术获得NK4基因的cDNA,并引入酶切位点,先转入感受态质粒,再转化大肠杆菌进行扩增,筛选阳性克隆菌落,经酶切及测序,证实NK4基因已转入,并与构建好的pBudCE4.1-EGFP载体连接,制备出标记GFP(荧光)的双基因载体。酶切鉴定构建成功后,脂质体法将NK4质粒(选上述实验构建)转染至子宫颈癌细胞中。筛选阳性克隆进行指标检测:转染细胞NK4基因mRNA水平,蛋白表达的检测,及对Hela细胞生长,转移抑制研究。1、根据NK4的cDNA序列设计一对引物2、RT-PCR,产物1.0%琼脂糖凝胶电泳凝胶成像分析系统分析测定3、克隆NK4目的片段并鉴定4、重组质粒载体的构建与鉴定:获得pBudCE4.1-EGFP/HGF双基因表达载体。5、细胞培养及细胞转染脂质体法NK4质粒(上述实验构建成功)转染至子宫颈癌Hela细胞中。6、筛选阳性克隆进行指标检测:转染细胞NK4基因mRNA水平表达的检测(实时荧光定量PCR法);转染细胞NK4基因蛋白表达的检测(Western blot法)7、转染细胞荧光显微镜观察及生长曲线的测定细胞分组:正常对照组,空白载体转染组,NK4稳定转染组8、细胞凋亡检测:流式细胞仪FCM测定,用CELLQuest软件分析细胞凋亡,结果以凋亡细胞的百分率表示。9、转染NK4基因对Hela细胞运动转移抑制研究:采用Transwell小室法观察转染Hela细胞运动和转移的影响;通过实时荧光定量PCR法检测转染Hela细胞中的FN,MMP-2,MMP-9的表达。结果1、合成并克隆NK4基因片段并鉴定:凝胶电泳观察到约1326bp的NK4片段,构建含有NK4基因的真核表达载体(荧光标记)pBudCE4.1-e GFP/NK4质粒,NK4基因PCR扩增结果及重组质粒酶切的鉴定结果,切出约1326bp的片段,表明NK4片段插入pBudCE4.1-EGFP载体中,最终获得pBudCE4.1-EGFP/NK4载体。基因序列测序结果与Genebank序列一致。2、脂质体法NK4质粒转染子宫颈癌Hela细胞系中,转染细胞NK4基因mRNA水平可见阳性表达,且平均表达量为对照组的3.84倍;Western blot检测NK4基因蛋白水平的检测结果显示在培养液上清中可检测到一特异性条带,大小约50 Kd,与NK4蛋白预期分子量大小一致,证明重组质粒能有效介导目的基因NK4的表达。3、转染细胞生长曲线的变化通过直接计数法检测NK4基因转染前后的细胞生长情况,Hela细胞在前5天和10天的群体倍增时间分别为22h和24h,自第三天起进入对数生长期,与空载体组无显著差别。Hela/NK4细胞在前5天和10天的群体倍增时间为30h和28.2h,第3天进入对数生长期,至第10天最大细胞数为1.9×10~6,稍低于非转染细胞的2.5×10~6二者比较没有显著性差异(P＞0.05)。细胞凋亡检测:转染细胞组72h细胞凋亡率为30.4%,高于空载体组的22.1%和对照组的11.4%。Hela/NK4细胞组与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)。4、转染NK4基因对Hela细胞运动转移的发现:在不加HGF的情况下,转染空载体或NK4基因对Hela细胞的运动和转移没有影响(P＞0.05);与不加HGF的空白对照组相比加HGF的Hela细胞组和转染空载体组细胞的运动和转移指数显著高于空白对照组(P＜0.05);而转染NK4基因可显著抑制HGF所诱导的Hela细胞的运动和转移(P＜0.01),转染空载体组则无此作用(P＞0.05)。结果显示转染NK4的Hela细胞细胞中基质金属蛋白酶(MMP)-2和-9表达减低,尤其MMP-9相对降低明显,与对照组比较,差异有显著性(P＜0.05)。结论1、构建pBudCE4.1-EGFP/NK4真核表达载体并鉴定。2、转染子宫颈癌细胞系成功,转染细胞NK4基因mRNA水平及蛋白表达水平表达阳性,确认NK4的Hela细胞生长及促进其凋亡的结论。3、转染NK4基因可抑制Hela细胞的运动和转移,在子宫颈癌抗转移治疗中可能具有重要作用。为进一步建立动物移植瘤模型,探讨NK4在动物体内的抗肿瘤作用提供实验依据。为妇科恶性肿瘤的基因治疗提供依据。