青蒿(Artemisia annua L)为菊科蒿属一年生草本,传统中药,具有清热解暑、除蒸、截疟的作用。其叶片及花蕾提取青蒿素,为目前青蒿素类药物的唯一原料来源。我国学者根据传统中医药,首先从青蒿中提取并自主研制出青蒿素类药物,是四大传染疾病之一——疟疾的唯一特效治疗药物,其高效、速效、安全被世界广泛认可,成为首个被收入世界药典的中药,在世界卫生组织(WHO)推动下,已有超过50个国家和地区将其列为抗疟首选指定用药。青蒿虽是世界性的广布物种,但仅极少数地区青蒿素含量相对较高,能达到工业提取水平之上。而重庆则是这极少数地区之一。在这极少数地区发展青蒿种植业,可以拯救数以亿计疟疾患者,具有极重大社会意义,而且,有利于将独特资源优势转化为经济优势,也具有极显著经济效益。同时,青蒿素也为传统中药树立形象,对其它中药走向世界具有引领作用。青蒿种植和青蒿素生产具有如此重要意义,那么,选育高含量品种,以及通过栽培技术提高青蒿素含量和产能,成为我们面临的关键而十分紧迫的课题。特别是青蒿素含量至关重要。基于此,本文以提高青蒿素为研究核心,围绕种质筛选和栽培两个方向,展开4个部分的研究：1青蒿素含量的测定(1)测定方法的建立与评价分别建立紫外分光光度法(UVSPM)和高效液相色谱法(HPLC)测定青蒿素,方法学研究表明两方法操作简便、稳定性高、精度准、重现性好。分别对9个样品两次重复进行测定,结果经t检验,表明两种方法测定青蒿素含量的没有差异(p=0.4527)。(2)样品的提取采用(L9(34))正交试验方案,研究提取溶剂、溶剂用量、提取温度和提取时间4因素对提取效果的影响,结果表明：提取温度是最为关键的因素,40℃最佳,低于或高于40℃提取效果都不好；提取溶剂对提取影响显著,宜选石油醚(30-60℃)；提取剂用量(料液比)对提取效果影响极显著,宜选50 mL；提取时长对提取结果影响极显著,宜选2小时。进一步对比试验表明：超声波可以缩短提取时间或降低提取次数,同时可减少提取溶剂用量；增加取剂用量和缩短提取时间之间,可以很好互相弥补,增加提取次数比延长提取时间更有效。5种组合方案为优选提取方法,它们提取效果好,彼此无差异。(3)样品采后干燥方法晒干、40℃烘干效果最佳,阴1天后再晒干或40℃烘干,对结果也没有显著影响；自然风干则含量显著降低；烘干超过40℃后,青蒿素含量则随温度升高而极显著降低。(4)样品储存储存时长、温度、样品水分含量和包装4因素对青蒿储存过程中青蒿素含量变化影响都极显著。青蒿素含量随储存时间而降低,但前2个月,趋势总体上相对平稳,之后降幅增大、降速加快；样品水分含量越高青蒿素衰降越快且幅度越大；4℃低温青蒿素衰降比常温平稳；包装的影响则取决于样品的水分含量和温度,低温时：青蒿素含量高低顺序为：纸袋+塑料袋+干燥剂>塑料袋>纸袋,高水分含量、室温时,凡有塑料袋都加速青蒿素衰降。包装的实际作用是防潮,因此,除时间外,样品储存的最关键因素是样品水分含量和温度,即样品始终要处在低水分含量、低温度条件下。干燥度高(储存前40℃烘干至恒重的样品,水分含量5%-7%),4℃低温条件,储存1年后青蒿素还保有90%左右,采用纸袋+塑料袋+干燥剂的包装,最好效果青蒿素含量可以1年后仍然有95.5%。相反,而湿润环境下的样品风干样(水分含量15%-16%)、室温储存,无论什么包装,长时间储存都会让青蒿变得没有价值,1年后,青蒿素含量最低仅剩不到30%左右。2重庆青蒿资源及生境调查分别于2005、2009年共调查重庆148个样品点青蒿及其生境,结果如下：(1)青蒿品质全市平均青蒿素含量为5.92g·kg-1,幅度1.09-13.03g·kg-1。青蒿品质表现很强的地域性的分布特点：渝东南(酉阳)片区含量最高,极显著高于其他3片区,是其它3片区的1.5-2.5倍左右,尤其2005年野生资源。栽培青蒿品质较野生青蒿有极显著提高,2005、2009年和两年总计全市栽培较野生青蒿素含量分别提高34.5%、24.4%和29.5%,同时栽培也提高了青蒿品质的整齐度。从时间演变来看,2009年品质较2005年总体上有小幅提高(7.88%)。其中,主城(北碚)、渝东(万州)和渝西(永川)有较大幅度提高或提高趋势；但优质资源地的渝东南(酉阳)则呈相反的变化,野生和栽培青蒿品质都呈下降趋势(野生、栽培和总平分别下降11.1%、8.10%、9.57%)。(2)生境因子水文、光照和土壤质地极显著地影响青蒿素含量,土壤类型的影响则很小。水文条件好,青蒿素含量愈高,且变异系数越小,4个水文等级青蒿素含量高低相差2.26倍。光照充足有利于青蒿素含量提高,遮荫则大幅降低青蒿素含量,4个光照等级青蒿素含量高低相差3.3倍。4个质地等级中,最适宜的质地为“偏重”,然后为“偏轻”和“重”,质地“沙”不利于青蒿中的青蒿素。调查的中的紫色土、水稻土、黄壤3种土壤类型对栽培青蒿的品质没有影响,野生青蒿则水稻土、紫色土显著高于黄壤。(3)生境土壤养分及与青蒿素含量相关性土壤有机质、碱解氮、有效磷和速效钾被测定。青蒿素含量与上述土壤养分均极显著正相关。(4)青蒿素与生境的土壤养分回归数量模型和通径分析以青蒿素含量为因变量(Y),有机质(X1)、碱解氮(X2)、有效磷(X3)和速效钾(X4)为自变量,分别能较好建立线性逐步回归、二次多项式逐步回归和引入高次及养分比的线性逐步回归方程式,回归系数和通径分析表明,影响青蒿素含量不仅有养分绝对数量和养分间交互作用,养分比例也同样发挥着重要作用。因此,青蒿种植需同时兼顾土壤中的养分数量和养分平衡。(5)重庆优质青蒿的土壤养分标准与诊断去掉水文光照条件极端、青蒿素含量居中的样点,剩下分为青蒿素高含量和低含量两个样本群组, t-检验比较土壤养分和养分比例,都存在显著性差异。采用植物营养中养分综合诊断法,以高含量组土壤平均有效氮磷钾及其比例平均值,结合其一定范围的置信限,建立重庆优质青蒿的土壤养分标准,按这一标准进行养分诊断和推荐施肥。3青蒿种质材料评比与筛选(1)种质材料间性状差异50份来源于重庆及周边省份青蒿种质材料,田间试验,在同一肥水、环境和管理条件下,多数不同种质材料间不仅在青蒿素含量、青蒿素单株产量存在极大差异,还在生物量、生物量比重、植株形态、生长期共计21个指标存在极显著差异。巨大的差异,不仅表明青蒿材料间差异大,也更表明青蒿种质资源的丰富,还表明种质材料筛选很必要。(2)种质材料筛选①优质种质材料筛选：按青蒿素含量高低,筛选出高含量材料13份,其中,超过9.5 g·kg-1的超优质材料6份,8.5-9.5 g·kg-1的优质材料7份。②高品质与高产能的复合筛选：按青蒿素含量和单株青蒿素产量,筛选出优质超高产型材料3份(青蒿素含量产量分别8.5-9.5g·kg-1和≥1.5 g·plant-1),超优质高产型材料5份(≥9.5 g·kg-1和1.2～1.5 g·plant-1),超优质中产型材料1份(≥9.54 g·kg-1和0.874 g·plant-1)；质中超高产型材料1份(8.062 g·kg-1和1.626 g-plant-1),质次超高产型材料1份(7 g·kg-1和1.58 g-plant-1)。③生长期型种质材料筛选：根据生长期长短,划分为超早熟型(或超短生长期型)、早熟型(或短生长期型)、中熟型(或中生长期型)、晚熟型(或长生长期型)、超晚熟型(或超长生长期型)。其中,多数晚熟型(或长生长期型)材料,来自(或最初来自)武陵山地域,其生长期与其它材料截然分开,可能是该地区资源保持独特优质地域性的原因。④其它性状种质类型：试验共分出3种株型：分枝型、主干型、丛生型,3种茎色型：紫色、黄色和绿色；不同一级分枝数等类型：根据本试验可以分多分枝型、少一级分枝型等。(3)主要农艺性状与青蒿素含量和产量的相关性①青蒿素含量与单株叶产量呈显著正相关,与其它生物量指标包括主茎、枝干重、地上部分、根干重、总生物量等之间相关关系都不显著,与生物量比重各指标不显著。青蒿素含量与株高、茎粗、一级分枝数和一级分枝长等形态指标之间相关关系都不显著。3种茎色青蒿材料间,紫色极显著高于绿色,显著高于黄色,后两者差异不显著。青蒿素含量与现蕾期、始花期、盛花期有一定程度正相关性但也未达到显著水平。按4种生长期类型统计,则发现生长期过短过长都不利青蒿素含量,晚熟型平均最高,与中熟型的均值间差异未达显著水平,但显著高于早熟型,极显著高于超晚熟型。②青蒿素单株产量与青蒿素含量、单株叶产量、主茎、分枝、地上部分、根干重、总生物量极显著正相关,与株高极显著正相关,与茎粗、一级分枝数显著正相关,但与各生物量比重指标相关性不显著,与一级分枝长关系不显著。3种株型中,分枝型极显著高于丛生型,主干型居中,与两者差异都不显著。3种茎色型中,紫色茎杆极显著高于绿色,黄色茎杆居中,与紫色、绿色的差异均不显著。生长期：晚熟型平均1.102 g·plant-1最高,与中熟型的均值0.881 g·plant-1间差异未达显著水平,但显著高于早熟型的0.636 g·plant-1,极显著高于超晚熟型的0.380g·plant-1;中熟型与早熟型差异不显著,但显著高于超晚熟型；早熟型与超晚熟型间差异未达显著水平。(4)青蒿素含量、产量与主要农艺性状回归方程的建立与通径分析青蒿素含量、产量分别与主要农艺性状(生物量、生物量比重、植株形态生长期等指标)建立起线性逐步回归方程和二次多项式逐步回归方程,二次多项式的拟合度更好。回归和通径分析表明,一定程度可依据某些农艺性状判断种质的叶产量、青蒿素单株产量甚至青蒿素含量,但判断青蒿素含量的可靠性并不大。4氮磷钾肥和密度对青蒿生长和青蒿素产量的影响L16(45)正交设计田间试验,研究氮磷钾肥和密度对青蒿生长和青蒿素产量的效应,结果表明氮磷钾肥和种植密度的单因素及其组合对青蒿株高、茎粗、生物量、青蒿素含量与产量、青蒿叶养分含量与累积量等指标都影响极大,合理的肥料用量和密度对青蒿种植十分重要。其中,对青蒿个体和群体的生物量作用效果氮肥和密度较磷、钾肥大,对叶片青蒿素含量的影响氮、钾肥比磷肥和密度更为突出。(1)单因素效果氮肥：适量氮肥有利于青蒿株高和茎粗的生长,但对一级分枝数作用不大；增加青蒿单株和群体的生物量积累、叶产量,增加青蒿叶部氮磷钾养分的含量和累积量,但高水平的施氮对上述指标进一步增加作用有限,甚至一定程度降低叶钾含量和累积量；适度的氮肥显著提高青蒿素含量和产量,但容易过量,过量氮大幅度降低青蒿素含量,从而降低青蒿素产量。因而对青蒿素含量和产量而言,把握氮肥用量很重要,综合各指标特别是青蒿素含量和青蒿素群体产量,最适宜的施氮水平为尿素650(N300) kg·hm-2。磷肥：增加青蒿株高和茎粗,对一级分枝数有一定正效应；增加高青蒿生物量积累和叶产量,青蒿叶部氮磷钾养分的含量和累积量；提高叶片青蒿素含量和产量。但高水平施磷对青蒿生长、生物量积累、叶产量、叶部养分含量和积累、青蒿素含量和产量的进一步提升效应并不显著,虽然如此,也没有如氮那样因过量而产生负效应的现象。同时,磷对叶生物量比重也没有明显效果。就单因素肥效应而言,施普钙量应该不少于1250 (P2O5150) kg·hm-2,但同时综合磷肥效应和肥料效益,最适宜的施磷水平为普钙1250-2500(P2O5150～300) kg·hm-2。钾肥：增加青蒿的株高和茎粗,对分枝数没有效应；有降低叶氮、叶磷含量的效应,但增加叶钾含量和叶氮磷钾累积量；对青蒿总生物量和叶产量、青蒿素含量和产量,有与磷肥相似的提升效应且没有负效应,提高青蒿素含量的作用较磷更强。综合钾肥效应和肥料效益,最适宜的施钾水平为氯化钾350(K2O210) kg-hm-2。密度：对株高总体上稍有降低作用,而减小茎粗作用强,对一级分枝数没有作用;青蒿个体植株的总生物量和叶产量随种植密度增大而极显著减少,但适当增大密度能提高群体总生物量和叶产量,也有利光合产物形成叶产量：高密度降低叶部氮磷养分含量,同时因减少了单株叶产量,因而对叶部养分的单株累积量的减少作用极显著,但对叶部养分的小区累积量是增加的。过高的密度会显著降低青蒿素含量,降低单株和群体的青蒿素产量。以青蒿素小区产量来看,适宜的种植密度为25000 plant·hm-2。(2)试验处理组合间效果比较本试验16个组合处理彼此间的青蒿形态、养分、生物量、青蒿素含量和产量等约20个指标,彼此之间差异大。因此优选很有必要,其中：单株叶产量高低相差2.12倍、小区叶产量2.76倍,青蒿素含量高低相差1.2倍,青蒿素单株产量高低相差2.3倍、青蒿素小区产量3.2倍。(3)合理肥密的组合方案优选氮磷钾肥和密度对青蒿的各主要指标的作用效应是不一致的,而种植生产中,当以青蒿素小区产量和青蒿素含量作为种植的最终目标。据此,本试验组合的优选方案为处理12(N3P4K2密度3,即N300 kg·hm-2、P2O5450 kg·hm-2、K2O 105 kg·hm-2、密度25000 plant·hm-2),可以获得青蒿素最高小区产量,同时青蒿素含量也高。按单因素效应的优选方案为：施氮水平3(N 300 kg·hm-2),施磷≥水平2(P2O5 150 kg·hm-2),施钾≥水平3(K2O 210 kg·hm-2),种植密度水平3(25000 plant·hm-2)。因此,单因素最优的组合和处理12在进一步对比试验后,可以形成合理施肥、合理密度的青蒿优质高产的技术方案,并推广到重庆青蒿主产区的生产实践中。(4)青蒿素含量、产能与植物形态、叶部养分间的相关性青蒿素含量与叶钾含量极显著正相关,与叶氮含量、叶磷含量不显著；与茎粗极显著正相关；与单株叶产量、单株总生物量的存在不太紧密的正相关性。青蒿素单株产量与叶氮、叶钾含量显著正相关,与叶磷含量相关性也比较高(p=0.072)。青蒿素小区产量与叶氮含量显著正相关,与叶磷、叶钾含量相关性不显著。(5)青蒿素含量产能与植物形态、叶部养分间回归模型以青蒿形态、叶部养分指标为自变量,建立青蒿叶产量、青蒿素含量、青蒿素产量的线性逐步回归方程,方程的显著性检验、决定系数和Durbin-Watson统计量表明所建模型好而有效。其中,①单株叶产量=-158.46+152.6·茎粗+5.737·叶氮含量-32.803·叶磷含量-5.559·叶钾含量(R2=0.9576,p=0.0000)。②当调整相关系数Ra最大时,青蒿素含量=8.4043+0.8443·茎粗-0.06296·级分枝数+0.08246·叶钾含量(R2=0.8471,p=0.0000)。当以回归系数完全显著时,青蒿素含量=5.2187+0.1108·叶钾含量(R2=0.7875,p=0.0000),仅叶钾含量为自变量。③青蒿素单株产量=1.2111-0.01845·一级分枝数+0.1129·叶氮单株累积量+0.1528·叶钾单株累积量(R2=0.9909,p=0.0000)。④青蒿素小区产量=24.5481-0.9067·叶氮含量+0.2272·叶氮小区累积量+0.2498·叶钾含量+0.4517·叶钾单株累积量(R2=0.9915,p=0.0000)。上述方程和通径一致显示,叶养分中,氮磷特别是氮对生物产量作用大,而钾对青蒿素含量作用重要。