桑叶(Mulberry Leaf)作为一种传统的中药材,其具有降血糖、降血脂、延缓衰老、抗菌、抗病毒等生理活性。研究表明,桑叶中的黄酮、生物碱、多糖等成分是其药理活性的物质基础。近年来,关于桑叶中多羟基生物碱(PHAs)的研究和开发越来越受到国内外学者的青睐,现代研究表明桑叶中PHAs类化合物可抑制小肠上皮细胞中的Q-葡萄糖苷酶的活性,降低餐后血糖。德国拜耳公司以PHAs类化合物1-脱氧野尻霉素(1-Deoxynojirimyein,简称DNJ)为先导物质,经过结构修饰合成研制出一线抗糖尿病药物米格列醇。本课题组通过液相色谱质谱联用技术,探索桑叶中多种PHAs的季节性含量变化,以期为合理开发利用桑属资源提供科学依据。PHAs分子结构中不含有苯环、双键、羰基等发色基团,在紫外光波段内无明显吸收峰；且其结构与糖类相似,含有大量羟基亲水基团,化合物极性很大,在反相色谱柱上保留的时间很短。以上原因导致PHAs不能采用常规的反相-紫外高效液相检测法。目前多利用荧光试剂芴甲氧羰酰氯(FMOC-CL)进行柱前衍生。对于其定性的检测方法有衍生化后紫外可见分光光度法、高效液相色谱法、离子色谱法、气相色谱法及蒸发光散射检测器法等。由于DNJ提取液为有色溶液,少量颜色的存在一定程度上会对溶液的吸光度产生影响,而柱前衍生化操作繁琐,需要严格控制反应条件,考虑产物的复杂性和稳定性等因素。本课题采用高效液相色谱-质谱联用技术,以HILIC亲水色谱柱分离分析材料,针对大极性、无紫外发色基团多羟基生物碱类化合物,开发出一种分析检测的方法。本研究选用米格列醇为内标(IS),针对鲁桑(Morus.multicaulis.Perr)、白桑(Morus.alba.L)、广东桑(Morus.atropurpurea.Roxb)和长穗桑(Morus. wittiorum. Handel-Mazzetti)4种桑属植物来源的叶片中的多羟基生物碱1-脱氧野尻霉素(DNJ)、类荞麦碱(Fagomine)-.2-氧-α-D-吡喃半乳糖苷野尻霉素(2-O-α-D-galactopyranosyl-DNJ)和4-氧-β-D-吡喃葡萄糖糖苷-荞麦碱(4-O-β-D-glucopyranosyl-fagomine)进行研究,并对桑叶生长周期从4月到10月其叶片中PHAs含量变化的趋势进行检测。本课题组在对样本前处理方法进行优化的基础上,以乙醇：水=(1：1,v/v)为溶剂,采用超声加热法进行提取。采用HILIC柱,以0.1%甲酸、20mmol/L甲酸铵和乙腈做流动相,梯度洗脱。ESI电离源下,MRM正离子模式对目标化合物进行定性定量分析。以m/z164.3→146.1(DNJ)、m/z148.2→130.2(Fagomine)、m/z310.4→148.3(4-O-β-D-glucopyranosyl-fagomine)、m/z326.4→146.5(2-O-α-D-galactopyranosyl-DNJ)、m/z208.2→146.1(IS)作为目标化合物的定量离子对。目标化合物保留时间均在4min以内。定量下限均为0.01ng/mg,日内和日间精密度RSD都小于10%。结果证明,该检测方法稳定、重现性好、快速、适用于大批量样本的测定。对广东桑、长穗桑、鲁桑和白桑在4-10月份生长周期中DNJ、Fagomine、2-O-α-D-galactopyranosyl-DNJ、4-O-β-D-glucopyranosyl-fagomine四种生物碱共84份样品的含量进行测定。结果显示：(1)、4-10月,4种桑叶中DNJ的含量的变化规律相似：DNJ含量在4～5月份达到最高值,之后皆呈现波动下降趋势,在8月份均略有回升趋势。(2)、4-10月,长穗桑中Fagomine的含量变化曲线呈现出逐渐升高近似抛物线图的增长趋势,并在8月份达到最高值。其他三个品种的桑叶中Fagomine含量在4-10月份总体呈波动下降趋势。(3)、长穗桑和白桑中4-O-β-D-glucopyranosyl-fagomine的含量随季节变化呈近似抛物线状,并在5月份达到最大值。而在鲁桑和广东桑中其含量呈现波动下降的变化趋势。(4)、4～7月份,白桑和长穗桑中2-O-α-D-galactopyranosyl-DNJ的含量先升高后降低,最高值出现在5月份；广东桑和鲁桑中2-O-α-D-galactopyranosyl-DNJ的含量则依次递减。结果表明：4种生物碱在不同季节不同品种的桑叶中含量差异较大,用液相色谱-质谱串联技术能快速、准确检测本文探究的桑叶生物碱,建立季节变化含量曲线图,有助于我们在今后的研究中更加明确采摘时间、合理开发利用桑叶资源。