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第一部分肝癌关联基因检测试剂盒的开发应用 目的:研究发现,肿瘤形成至少需要4-5步的遗传学突变,突变基因涉及12类信号通路的失调。不同的基因突变与患者临床特征、预后、治疗反应甚至治疗方法密切相关。本研究中我们对在肝癌中已发现的一些致病基因进行外显子捕获深度测序,从中探究深度捕获测序对于发现新型突变信息的价值以及了解肝癌亚克隆群体构成的意义。 方法:整合本课题组及其他研究人员已发现的肝癌关联突变基因(共94个),运用安捷伦公司的Solexa HaloPlex平台对候选的94个基因的97个区域设计了靶向捕获探针,并交由安捷伦公司合成了包含所有探针的试剂盒。随后运用lllumina高通量测序平台对不同肝癌样本的癌与相应的癌旁组织的基因组DNA靶向区域进行了深度测序,再对测序结果进行高级生物信息学分析,观察深度测序的研究价值。 结果:通过对33例肝癌患者样本的深度测序结果进行分析,我们首次发现了一些高频的突变基因;此外,有13例重测序样本检测到的部分突变信息在以往测序深度较低时并未检测到。 结论:该研究初步说明高深测序能够发现更多的突变信息,而部分位点的高频突变现象尚属于首次发现。 第二部分PDZRN4在肝癌中的作用 目的:我们之前的研究通过对21例乙肝病毒感染的AFP阴性肝癌病人癌组织的外显子测序发现,除了TP53发生较高频的突变外,PDZRN4基因(一种潜在的E3泛素连接酶)的具有较高的突变频率(11.9%)。本课题主要基于体外实验研究PDZRN4基因在肝癌细胞中的作用。 方法:采用半定量PCR评价PDZRN4基因在肝癌样本中癌组织与癌旁组织的表达水平差异以及PDZRN4基因在肝癌细胞系中的表达水平;利用荧光定量PCR技术分析PDZRN4基因及其家族成员在肝癌组织中的表达水平;构建PDZRN4基因的真核表达载体;利用免疫荧光观察PDZRN4蛋白在肝癌细胞中的定位;观察PDZRN4基因的过表达对肝癌细胞的增殖、克隆形成能力以及软琼脂克隆形成能力的影响。 结果:实验结果显示PDZRN4基因在多数肝癌样本中表达下调,而其家族的其他成员未见癌与相应癌旁表达水平有明显差异;PDZRN4基因在肝癌细胞系中未能检测到表达;外转的PDZRN4基因表达的蛋白定位在细胞核内;PDZRN4基因的过表达可以抑制SMCC7721、Huh7、Focus等肝癌细胞的生长和克隆形成以及软琼脂克隆形成。 结论:PDZRN4在肝癌样本中普遍下调表达,而且该蛋白在能够显著抑制HCC细胞的增殖。