珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂)作为典型的海水肉食性名贵鱼类,在养殖过程中发现过量的植物蛋白替代鱼粉易造成其肠道健康问题。本研究以其为实验对象(初重12.55±0.05g),分别采用20%、40%普通豆粕(SBM)、大豆浓缩蛋白(SPC)和发酵豆粕(FSBM)替代鱼粉配制等氮等脂实验饲料,饲喂10周;基于常规鱼类营养生理、转录组学和代谢组学技术,探究三种大豆蛋白源对珍珠龙胆石斑鱼肠道黏膜屏障影响,主要研究结果如下:1.普通豆粕对珍珠龙胆石斑鱼肠道黏膜屏障损伤的机制研究720尾石斑鱼随机分为3组(n=4):鱼粉对照组(FM)、20%SBM组(SBM20)和40%SBM组(SBM40),配制3种等氮(50%粗蛋白)等脂(10%粗脂肪)饲料饲喂10周。结果发现:与FM组相比,(1)实验组增重率(WGR)、特定生长率(SGR)随SBM替代水平增加依次显著降低(P<0.05);(2)半定量分析显示,SBM40组肠道炎症表征非常严重,SBM20组次之;后肠水通道基因1(Aqu1),Aqu4,Aqu8,Aqu9,Aqu10和Aqu12和离子转运载体Guanylin,nkaα-1和clc的基因表达水平显著降低;紧密连接蛋白基因occludin,claudin3和ZO-1基因表达水平显著升高;(3)后肠胰蛋白酶(Trypsin)活性随SBM替代水平增加呈显著上升趋势;(4)后肠抗氧化酶活性(总超氧化物歧化酶T-SOD、谷胱甘肽还原酶GR、谷胱甘肽过氧化物酶GPx)随SBM替代水平升高呈显著上升趋势;后肠促炎性基因IL1β,IL8,IL12,IL17,IL32,TNFα和CSF1的表达水平呈显著升高趋势,反之,抗炎性基因IL4,IL5,IL10,TGFβ1基因表达水平呈呈显著下降趋势;(5)16S高通量测序显示,在门水平上,相对丰度前10的物种分别为变形菌门(Proteobacteria),厚壁菌门(Firmicutes),拟杆菌门(Bacteroidetes),放线菌门(Actinobacteria)和蓝藻细菌门(Cyanobacteria)等。Proteobacteria丰度在SBM40组显著下降,而Firmicutes,Bacteroidetes和Actinobacteria丰度在SBM40组显著升高。在属水平上,相对丰度前10的物种分别为发光杆菌属(Photobacterium),粪杆菌属(Faecalibacterium),寡养单胞菌属(Stenotrophomonas),弧菌属(Vibrio)和奈瑟菌属(Neisseria)等。Faecalibacterium,Stenotrophomonas,Vibrio,Neisseria,拟杆菌属(Bacteroides),链球菌属(Streptococcus)等丰度在SBM40显著升高;(6)转录组差异基因趋势分析发现,有1296个基因(记为基因集Profile A)呈显著上升趋势;677个基因(记为基因集Profile B)呈显著下降趋势。代谢通路KEGG富集发现,Profile A中显著富集到的与免疫疾病/系统、感染病和信号转导有关的占55.17%;Profile B中显著富集到的与免疫疾病/系统(Immune diseases/system)、感染病(Infectious diseases)和信号转导(Signal transduction)有关的仅占6.98%,与营养物质吸收代谢相关的占67.44%。转录组分析发现,TLR-My D88-NF-κB通路在SBM诱导的珍珠龙胆肠炎中发挥了重要作用;(7)代谢组学分析显示,珍珠龙胆肠道内容物和肠道组织中,分别有14种和13种较为保守的豆粕诱导型肠炎“核心生物标志物”,其中异黄酮类和皂苷类占据较大比例,大部分标志物间具有显著正相关或负相关作用;肠道内容物代谢组学和肠道组织代谢组学间反相关分析发现,包括不饱和脂肪酸、有机酸、氨基酸、维生素、小肽和核苷酸等56种代谢成分在肠道组织和内容物间发生了交换,对肠炎的发生发展可能有重要的作用。结果表明,20%-40%SBM损伤了珍珠龙胆的肠道黏膜屏障并导致了肠炎的发生,肠道菌群的改变以及肠道中与免疫等相关信号通路的激活和营养吸收代谢通路的普遍抑制与肠炎的发生有密切的关系。2.大豆浓缩蛋白对珍珠龙胆石斑鱼肠道黏膜屏障损伤的机制研究720尾石斑鱼随机分为3组(n=4):鱼粉对照组(FM)、20%SPC组(SPC20)和40%SPC组(SPC40),配制3种等氮(50%粗蛋白)等脂(10%粗脂肪)饲料饲喂10周。结果发现:与FM组相比,(1)实验组WGR和SGR随SPC替代水平增加依次显著降低;(2)半定量分析显示,SPC40组肠道炎症表征非常明显,而SPC20组较轻;后肠水通道基因Aqu1,Aqu4,Aqu8,Aqu9,Aqu11和Aqu12的表达水平随替代水平的升高呈显著下降趋势(P<0.05),而Aqu10和紧密连接蛋白jam,claudin3和ZO-1基因表达水平在SPC40组显著升高,claudin12,claudin15和离子转运载体Guanylin,nkaα-1和clc基因表达水平在SPC40组显著降低。(3)后肠Trypsin酶活性随SPC替代水平增加呈显著上升趋势;(4)后肠抗氧化酶活性(T-SOD、GR和GPx)随SPC替代水平升高呈显著上升趋势;后肠促炎性基因IL1β、IL8、IL12、IL17和TNFα的表达水平在SPC40组呈显著升高趋势(P<0.05),反之,抗炎性基因IL4,IL5,IL10,TGFβ1基因表达水平在SPC40组呈显著下降趋势;(5)16S高通量测序显示,在门水平上,相对丰度前10的物种分别为Proteobacteria,Firmicutes,Bacteroidetes,Actinobacteria和Cyanobacteria等。Proteobacteria丰度在SPC40组显著下降,而Firmicutes,Bacteroidetes和Actinobacteria丰度在SPC40组显著升高。在属水平上,相对丰度前10的物种分别为Photobacterium,Faecalibacterium,Vibrio,Bacteroides和双歧杆菌属(Bifidobacterium)等。Photobacterium在实验组丰度依次显著降低,其余物种丰度在SPC40组显著升高;(6)转录组比较分析发现,SBM40和SPC40两组间只有17.2%(936/5445)差异基因有类似表达模式。KEGG富集发现,在显著富集到的与免疫疾病/系统、感染病和信号转导有关的代谢通路中,SBM40和SPC40共有差异基因富集到的占30.55%(11/36),SBM40组特有差异基因富集到的占43.55%(27/62),SPC40组特有差异基因富集到的仅占5.13%(2/39),而SPC40特有差异基因富集到的与营养物质消化吸收相关的占69.23%(27/39)。SPC40和SBM40均引起了产生Ig A的肠道免疫网络通路中Ig A的反常升高。结果表明,40%SPC对珍珠龙胆肠道稳态影响更加显著,并诱导了珍珠龙胆肠炎产生肠炎。与SBM诱导的肠炎相比,40%SPC诱导的肠炎可能是营养代谢失衡下引起的肠道免疫功能的紊乱所致。3.发酵豆粕对珍珠龙胆石斑鱼肠道粘膜屏障损伤的机制研究720尾石斑鱼随机分为3组(n=4):鱼粉对照组(FM)、20%FSBM组(FSBM20)和40%FSBM组(FSBM40),配制3种等氮(50%粗蛋白)等脂(10%粗脂肪)饲料饲喂10周。结果发现:与FM组相比,(1)实验组WGR和SGR随FSBM替代水平增加依次显著降低;(2)半定量分析显示,FSBM40组肠道炎症表征非常严重,FSBM20组次之;后肠水通道基因Aqu1,Aqu4和Aqu12及紧密连接蛋白jam,claudin3,claudin12,claudin15和ZO-3的表达水平显著下降,而Aqu8,Aqu9,Aqu10和ZO-1基因表达水平显著升高;离子转运载体nkcc和clc基因表达水平呈显著降低趋势;(3)后肠Trypsin酶活性随FSBM替代水平增加呈显著上升趋势;(4)后肠抗氧化酶活性(T-SOD、GR和GPx)随FSBM替代水平升高呈显著上升趋势;后肠促炎性基因IL1β,IL8,IL12,IL17,IL32,TNFα和CSF1的表达水平呈显著增加趋势,反之,抗炎性基因IL4,IL5,IL10,TGFβ1表达水平呈显著下降趋势;(5)16S高通量测序显示,在门水平上,相对丰度前10的物种分别为Proteobacteria,Firmicutes,Bacteroidetes,酸杆菌门(Acidobacteria)和Actinobacteria等。Proteobacteria丰度在FSBM40组显著下降,Bacteroidetes,Firmicutes,Acidobacteria和Actinobacteria丰度在FSBM40组显著升高。在属水平上,相对丰度前10的物种分别为Photobacterium,Stenotrophomonas,Vibrio,叶杆菌属(Phyllobacterium)和色盐杆菌属(Chromohalobacter)等。Photobacterium在FSBM40组丰度显著降低,其余各物种丰度总体显著升高;(6)转录组比较分析发现,SBM40和FSBM40两组间只有18.98%(920/5445)差异基因有类似表达模式。KEGG富集发现,在显著富集到的与免疫疾病/系统、感染病和信号转导有关的代谢通路中,SBM40和FSBM40共有差异基因富集到的占42.59%(23/54),SBM40组特有差异基因富集到的占47.17%(25/53),FSBM40组特有差异基因富集到的占42.11%(24/57)。分析发现,TLR-My D88-NF-κB信号通路在FSBM诱导的珍珠龙胆肠炎中发挥了重要作用。结果表明,20%-40%FSBM替代鱼粉影响了珍珠龙胆的肠道稳态,与SBM诱导的珍珠龙胆肠炎类似,肠道中与免疫等有关信号通路的普遍激活,对肠炎发生产生了重要影响。4.不同大豆蛋白源对珍珠龙胆石斑鱼肠道黏膜屏障损伤机制研究比较三种大豆蛋白源在40%替代水平下,均引起了珍珠龙胆石斑鱼明显的后肠炎症表征,本部分对该替代水平下三种大豆蛋白饲喂的珍珠龙胆的生长生理等进行比较分析。结果发现:与FM组相比,(1)WGR和SGR在各实验组中均显著降低,各实验组间无显著性差异,但SPC40组略高于SBM40组和FSBM40组;(2)半定量分析显示,SBM40与FSBM40组肠道炎症表征均非常严重,程度相当,而SPC40组肠炎严重程度显著轻于SBM40和FSBM40,但肠道炎症表征非常明显;后肠水通道基因Aqu1,Aqu4,Aqu8,Aqu9,Aqu10,Aqu11,Aqu12及紧密连接蛋白基因jam,occludin,claudin3,claudin12,claudin15,ZO-1和ZO-3和离子转运载体基因nkcc,guanylin,nkaα-1,clc的表达水平均受到了不同程度的显著性影响;(3)后肠Trypsin酶活性在各实验组中均显著升高,且在SPC40组显著高于其他两实验组;(4)后肠抗氧化酶活性(T-SOD、GR和GPx)在各替代组呈显著上升趋势,且在SPC40组中活性最高;后肠促炎性基因中,除IL32和CSF1基因表达水平在SPC40组无显著差异外,IL1β、IL8、IL12、IL17、IL32、TNFα和CSF1基因表达水平在各实验组中均呈显著升高趋势,反之,抗炎性基因IL4,IL5,IL10,TGFβ1表达水平在各实验组中均显著下降;(5)16S高通量测序显示,在门水平上,相对丰度前10的物种分别为Proteobacteria,Firmicutes,Bacteroidetes,Acidobacteria,Actinobacteria和Cyanobacteria(蓝藻细菌门)等。Proteobacteria在各实验组中丰度均显著下降,其中FSBM40组丰度显著高于SBM40和SPC40组。Firmicutes,Bacteroidetes和Actinobacteria丰度在各实验组均显著升高,Acidobacteria丰度在SBM40组和SPC40组无显著变化,在FSBM40组显著升高。在属水平上,总体上相对丰度前10的物种分别为Photobacterium,Stenotrophomonas,Vibrio,Phyllobacterium,Neisseria和Bacteroides等。Photobacterium在各实验组中丰度均显著降低。Phyllobacterium和Neisseria丰度在SPC40组无显著差异,unidentified＿Rikenellaceae丰度在SPC40和FSBM40组无显著差异。其余各物种丰度在各实验组中均显著升高(P<0.05),在各实验组间具有一定的差异性;(6)转录组比较分析发现,SBM40、SPC40和FSBM40三组间只有7.80%(554/7101)差异基因有类似表达模式。KEGG富集发现,在显著富集到的与免疫疾病/系统、感染病和信号转导有关的代谢通路中,SBM40、SPC40和FSBM40共有差异基因富集到的占30%(9/30),SBM40组特有差异基因富集到的占45.10%(23/51),FSBM40组特有差异基因富集到的占60.53%(23/38),SPC40组特有差异基因富集到的占2.86%(1/35);而SPC40中,与营养物质吸收代谢相关通路显著富集到的占67.44%。分析发现,TLR-My D88-NF-κB信号通路在SBM40和FSBM40诱导的珍珠龙胆肠炎中发挥了重要作用。结果表明,40%替代水平的SBM、SPC和FSBM均引起了珍珠龙胆肠道黏膜屏障损伤并导致了肠炎的发生;SBM和FSBM诱导的珍珠龙胆肠炎通路变化有一定的保守性;SPC诱导的肠炎可能营养代谢失衡下引起的肠道免疫功能的紊乱所致。